一张图介绍5hmC检测方法

　　

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生物通报道： 被称为"第六种碱基"的5-羟甲基胞嘧啶(5-hydroxymethylcytosine, 5hmC),广泛分布于多种哺乳动物的组织和细胞中,与胚胎发育,神经系统功能以及肿瘤研究高度相关.与5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine, 5mC)相比,5hmC在组织中含量更低,难以精确的检测.

随着研究的深入,5hmC参与的重要生物学作用逐渐被人们发现,同时也促使着5hmC的检测和定量方法不断发展.为了区分5hmC与其他胞嘧啶衍生物,很多利用化学或者酶学修饰实现靶向检测或非靶向富集5hmC的方法应运而生.因此,选择并发展灵敏,准确,可靠的5hmC检测技术对于表观遗传研究至关重要.来自第四军医大学基础医学部神经生物学教研室暨脑科学协同创新中心的研究人员为此重点综述了近年来发展起来的5hmC检测和测序技术,通过比较分析各种方法的优缺点,为研究人员选择特定合适的方法开展相关研究提供重要的参考.

5-羟甲基胞嘧啶(5-hydroxymethylcytosine, 5hmC)最早于1952年在噬菌体DNA中被发现。它能被糖基转移酶介导发生糖基化修饰，从而使噬菌体DNA在进入宿主后能抵抗宿主限制酶的降解。但当时5hmC的功能并没有引起更多的重视。直到2009年，Heintz和Rao研究组分别在同期Science杂志上报道了在人和小鼠的脑、胚胎干细胞DNA中含有丰富的5hmC，这才让更多的研究人员重新着手认识这个修饰碱基。

但与经典的5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine，5mC)相比，5hmC的作用与功能并不完全清楚。作为重要的表观遗传标记，5hmC可能与DNA去甲基化和转录调控相关；同时人们发现5hmC在基因组中的分布不仅表现出不同于5mC的普遍性和动态特征，并且参与了重要的细胞功能调控，涉及干细胞的多能性、细胞发育分化和癌症的发生与发展等方面。此外，5hmC的分布和含量已经开始被作为许多癌症疾病早期诊断和预后的重要标志之一｡因此，5hmC的研究在生物医学领域具有极其重要的意义。

若要了解5hmC在生理过程中的作用，掌握其在基因组DNA中的定量和定位信息是非常必要的。但研究最初却面临着巨大的技术挑战：一方面是因为当时标准的生物化学方法不容易区分5mC和5hmC；另一方面是由于哺乳动物基因组中的胞嘧啶衍生物在胞嘧啶中所占的比例很低，因此精确检测其含量十分困难。近几年来，相关分析与测序技术快速发展，大大促进了人们对5hmC的探索研究和其生物学功能的认识。

在最初发现5hmC时，大量的研究利用传统色谱、质谱以及特异性抗体识别的方法对不同来组织和细胞的基因组DNA中5hmC和5mC的水进行了比较分析；后来出现了各种针对5hmC的学修饰、酶学修饰方法，大大提高了检测5hmC灵敏度和特异性。随着高通量测序技术的逐渐普应用，结合新的5hmC富集、修饰方法的出现，研究人员实现了在单碱基水平检测5hmC在基因组位的目标；此外，第三代测序技术不需要经过D的扩增与修饰，也已经被应用于检测各种胞嘧啶生物的基因组定位研究。这些方法各有所长在实际应用中可以相互补充。这篇文章主要针对5h检测技术取得的研究进展进行综述，以期为开展关研究的工作人员提供重要的参考。

文章指出，随着表观遗传学研究的不断深入，人们对于5hmC的生物学功能认识更加完善，而这些进展在很大程度上得益于不同层次的针对5hmC的检测和测序技术的发展。在实际的科研工作中，应该结合研究的需要和方法的可行性，首先选择定性或半定量的检测技术，如利用特异性抗体完成免疫荧光，或者采用薄层色谱大致了解特定组织中5hmC分布和含量情况。还可以采用抗体、限制性内切酶及其他化学修饰的方法富集含有5hmC的DNA片段，再进行各种下游分析，比如PCR检测、芯片、测序等等。

当需要详尽了解特定细胞或组织中5hmC的基因组分布时，就可以选择使用几种可以实现单核苷酸分辨率的测序方法了，如TAB-Seq、OxBS-Seq、Aba-Seq和Pvu-Seal-Seq和RRHP。而 在5hmC的研究中，各种新的化学修饰方法不断出现，包括第三代测序技术，如SMRT，也应用于检测5hmC的分布和水平。这些方法在很大程度上提高了5hmC检测的效率。与此同时，另外两种胞嘧啶碱基修饰—5caC和5fC，在如火如荼的表观遗传学研究中逐渐引人注目。相信通过研究人员的不断应用发展，各种技术方法逐渐成熟，将会吸引更多的科学家进入这一重要的研究领域。

原文检索：

方科, 张凯翔, 王建, 付志猛, 赵湘辉. 表观遗传学新标记--5-羟甲基胞嘧啶检测方法的研究进展[J]. 遗传, 2016, 38(3): 206-216.
Ke Fang, Kaixiang Zhang, Jian Wang, Zhimeng Fu, Xianghui Zhao. Advances on the profiling of 5-hydroxymethylcytosine. HEREDITAS(Beijing), 2016, 38(3): 206-216.