癌症免疫学四种方法经典论文（2014-2015）

　　

生物通报道：高通量测序技术促进了癌症和免疫学的研究，以及个体化免疫治疗的发展，比如说，高通量测序极大地促进了我们对癌症基因组，肿瘤发生过程中细胞内机制的了解，而且癌症基因组分析还揭示了免疫系统能靶向的抗原表位。同时测序也可以用于确定免疫组库，实时，高敏感地监控对肿瘤生长或治疗产生应答的克隆扩增和细胞群体浓度。

（T细胞介导的免疫功能：要构建一个成功的免疫应答，需要许多步骤。肿瘤特异性抗原来自死亡肿瘤细胞。新抗原（neoantigens）是肿瘤中的突变多肽，在正常组织中是不存在的，其通过抗原提呈细胞识别，而后提交给T细胞，在经过免疫检查点的时候激活T细胞。这些激活了的T细胞散布在血液系统中，当肿瘤被识别出来时，在系统T细胞应答建立之前必须经过其他检查点。图上橙色的文字指示的是发表论文中出现过的免疫调节治疗方法。）

疫苗免疫疗法（VACCINE IMMUNOTHERAPY）

Carreno BM, Magrini V, Becker-Hapak M, et al. Cancer immunotherapy. A dendritic cell vaccine increases the breadth and diversity of melanoma neoantigen-specif c T cells. Science. 2015;348 (6236):803-808.

来自华盛顿大学医学院的研究人员报告称，他们的一项临床试验的早期数据表明，一些个体化的黑色素瘤疫苗可用来激起强有力的免疫反应对抗患者肿瘤中的独特突变。

研究人员采用一种新方法开发癌症疫苗，他们首先测序了患者肿瘤以及健康组织样本的基因组，以鉴别出肿瘤细胞独有的突变蛋白即肿瘤抗原。然后，利用计算机算法及实验室测试，研究人员可以预测并测试出哪些肿瘤抗原最有可能激发有力的免疫反应，可以被用来纳入到疫苗中。

研究人员将这些疫苗给予了那些接受手术切除肿瘤但癌细胞已扩散至淋巴结的黑色素瘤患者。这些临床研究结果为获得美国食品和药物管理局批准开展I期疫苗试验创造了条件。这项试验将招募6名患者。

这篇Science论文报道了前三位患者免疫反应的相关数据。如果在更多患者中进行测试的结果证实疫苗是有效的，它们或许有一天会被拿来给予手术后的患者，刺激他们的免疫系统攻击残留的癌细胞及防止癌症复发。

Diken M, Kreiter S, Kloke B, et al. Current developments in actively personalized cancer vaccination with a focus on RNA as the drug format. Prog Tumor Res. 2015;42:44-54.

测序技术能帮助研究人员快速获取癌症患者的基因组特征和转录数据，揭示高度癌症特定变异。这是个性化医疗，以及癌症诊断的一大突破，这也为个体化医疗带来了希望。

癌细胞蛋白序列中的一些突变可以为研究人员提供免疫系统识别抗原的宝贵来源，用于开发疫苗。在多种可能的癌症疫苗形式中，以mRNA为基础，由于变异抗原表位编码的疫苗已经得到了可喜的成果，并且被证明具有临床前和临床安全性。

在活到老小鼠临产前证据后，2013年，激活个体化mRNA癌症疫苗首次引入临床I期。这种方法就是利用新一代测序技术比对健康和癌症患者样品，分析癌症突变组（mutanome）、免疫组（immunome）和转录组，然后让患者接受多肽编码RNA分子（患者特异性）的治疗。这样就能靶向特异性患者肿瘤中的多个抗原表位，因此适用于任何携带超过 1个突变的癌症。

过继细胞疗法（ADOPTIVE CELL TRANSFER）

Chimeric Antigen Receptor (CAR) T Cells

Morrison C. CAR-T field booms as next-generation platforms attract big players. Nat Biotechnol. 2015(6);33:571-572.

CAR-T细胞疗法是过继性免疫细胞治疗的一种，包括体外对T细胞修饰使其能靶向肿瘤抗原并产生相应免疫反应。CAR-T细胞治疗在CD19阳性白血病的早期治疗效果极其显著，使得市场对该领域开拓者Kite、Juno公司和最早做出巨资投资的Novartis公司超高估值。

在这些制药公司中，坐落于巴塞尔的Novartis公司仍然是个例外。自从2012年8月与宾夕法尼亚大学CAR-T细胞研究专家达成协议后，Novartis公司基因与细胞疗法部门总管Usman Azam说，Novartis公司在这一领域的投资已翻倍，尤其是在细胞疗法实现应用过程中的复杂工艺技术方面投入了大量的资金。瑞士制药公司在2012年12月以4300万美元购买了位于巴塞尔的Dendreon公司的免疫疗法的工艺设备。这个设备，也就是以前Dendreon公司用于生产第一个FDA批准的自体DC细胞疫苗Provenge的设备，对于Novartis公司的产品规模化生产有很大帮助。

如今医生开采用的肿瘤治疗手段与日俱增，CAR-T细胞治疗及其相关的技术能否占有一席之地还有待观察。一些以及通过商业合作方法涉足肿瘤过继免疫细胞治疗领域的肿瘤公司也采取了循序渐进以观其变的方式。一些公司希望看到CAR-T细胞对其它疾病的疗效后再做大动作；另一些可能希望等到下一代技术即由自体细胞向异体细胞成功转变后的通用性CAR-T技术，或者等到Intrexon公司或 Bellicum公司真的解决了副作用难题之后。除了关键的技术障碍，这些商场小伎俩并没影响大型巨头公司对这些风险热点的投入。

Remote control of therapeutic T cells through a small molecule–gated chimeric receptor

T细胞是人体内的重要免疫细胞。它们起源于骨髓，在胸腺内分化成熟，是机体抵御入侵者和癌细胞的主力军。

T细胞疗法在癌症治疗方面很有潜力，但副作用可能非常严重。为此，加州大学旧金山分校UCSF的科学家们开发了一个能够严格控制T细胞活性的分子开关。这一技术有望解决T细胞治疗的严重副作用，克服这种疗法的重要障碍。

嵌合抗原受体（CAR）T细胞技术是近年来备受关注的一种癌症免疫疗法。CAR插入T细胞之后，能赋予它们靶标肿瘤细胞的能力，进而启动一系列抗癌免疫应答。CAR包括一个抗原识别区域，能够识别肿瘤细胞表面的特异性蛋白；还包括一个细胞内区域，能够激活T细胞并促进其增殖。

CAR T细胞已被证明可以治疗多种抵抗化疗的白血病，但这些细胞也可能引起严重的副作用，甚至有患者因此而死亡。“T细胞就是一群猛兽，”Lim说。“激活它们会面临致命的风险。因此，我们需要控制移植后的T细胞活性。”

有些科学家为此开发了“自杀式开关”，在副作用太严重的时候杀死CAR T细胞。“这是在杀死自己的士兵，”Lim说。“意味着完全终止复杂而昂贵的治疗程序。”

UCSF的研究人员选择的策略与此正好相反，他们构建了默认关闭的新型CAR T细胞。这种T细胞也能靶向癌细胞，但是不激活任何免疫应答，除非患者服用特制的药物。这种控制性药物负责启动CAR T细胞，如果药物不再存在，这些T细胞就会恢复关闭状态。

TIL(肿瘤浸润淋巴细胞)

肿瘤浸润淋巴细胞（tumor infiltrating lymphocyte,TIL）是指那些离开血流进入到肿瘤中的白细胞。当存在大量的肿瘤浸润淋巴细胞时，表明机体启动了对抗肿瘤的免疫反应。在许多的癌症中，研究人员均开展了相关的研究，定量这些肿瘤浸润细胞，并将其数量与肿瘤特征和结果关联起来。

Rosenberg SA, Restifo NP. Adoptive cell transfer as personalized immunotherapy for human cancer .Science. 2015;348(6230):62-68.

2013年，Rosenberg领导的团队率先采用外显子测序技术，鉴别在患者中表达的突变蛋白，并用一种 MHC分子-抗原表位亲和力算法进行模拟预测评估，进而合成候选的抗原表位，开展免疫反应验证。通过此方法，研究人员能快速鉴别出了在患者肿瘤 细胞上表达，能被肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）识别的突变抗原。

2014 年，Rosenberg团队将该方法成功应用到临床，他们通过高深度外显子测序技术、免疫反应功能验证，筛选出一位转移性胆管癌患者的高频突变基因，并鉴定到其对应的TIL克隆，通过大量扩增该TIL克隆 并实施回输治疗，使患者的病情得到有效控制。 2014年底，另一个研究团队联合应用外显子测序技术、转录组测序技术、高通量蛋白质谱分析技术，及 MHC分子-抗原表位亲和力模拟预测技术，寻找到 能被T细胞识别从而高效激活免疫反应的多肽疫 苗，该个性化肿瘤疫苗兼具预防性疫苗与治疗性疫苗的效能。这篇综述主要介绍了其中相关的内容。

Robbins PF, Lu YC, El-Gamil M, et al. Mining exomic sequencing data to identify mutated antigens recognized by adoptively transferred tumor-reactive T cells. Nat Med. 2013;19(6):747-752.

美国国家癌症研究所等机构的科学家们开发出了一种新的流线化方法，可快速鉴别出黑色素瘤中可被肿瘤浸润淋巴细胞识别的独特突变抗原。过去的研究证实肿瘤浸润淋巴细胞能够减少癌症病变，这些独特的蛋白小片段是肿瘤浸润淋巴细胞的识别靶标。

在这项最新研究中，科学家对患者过继转移了自身的免疫细胞，近40% 的患者在至少5 年的时间内肿瘤完全消退。为了更好地了解它的作用机制，研究人员开发了一种新方法，有助于更快地筛查出这些肿瘤浸润淋巴细胞识别的突变抗原。

新方法采用了新一代 DNA 测序技术，挖掘全外显子序列数据，鉴别在患者中表达的突变蛋白。随后研究人员合成出候选的突变T细胞抗原表位，并用一种主要组织相容性复合物结合算法对候选表位进行了评估。利用这种方法，研究人员鉴别出了在患者肿瘤细胞上表达，能被肿瘤浸润淋巴细胞识别的突变抗原。

研究人员指出，新技术能够更快、更容易地鉴别出免疫系统T细胞识别的突变基因抗原。从前，研究人员都是通过生成以及费力地筛查来自肿瘤的DNA库，来完成这样的工作。这一新筛查技术有可能还适用于在许多癌症类型中鉴别突变抗原。

免疫检查点阻断（Checkpoint Inhibitors）

免疫检查点阻断（immune chenkpoint therapy）癌症疗法是一类通过调节T细胞活性来提高抗肿瘤免疫反应的治疗方法。

Sharma P, Allison JP. The future of immune checkpoint therapy. Science. 2015;348(6230):56-61.

目前，免疫检查点阻断疗法已经加入了由手术，放疗，化疗，靶向治疗等组成的"抗癌大军"中。由FDA批准的三种免疫疗法药物中，一种是特异性结合T细胞表面CTLA-4受体的抗体类药物，叫做ipilimumab，于2011年得到批准。另外两种是特异性结合T细胞表面PD-1受体的抗体类药物，分别叫做pembrolizumab与nivolumab，于2014年得到批准。

以上这几种药物并不直接作用于肿瘤细胞，而是通过作用于T细胞类间接杀伤肿瘤细胞；另外，它们并不是针对肿瘤表面的某些特定物质，而是系统性地增强了全身的抗肿瘤免疫反应。具体来讲，在一小部分特定的癌症类型中，CTLA-4抗体类药物已经能够有效延长患者寿命长达十年。

Sharma P, Allison JP. Immune checkpoint targeting in cancer therapy: toward combination strategies with curative potential. Cell. 2015;161(2):205-214.

在过去30年里研究者已经阐明了许多参与癌症发生的分子机制，而同时研究者也鉴别出了许多可以诱发癌症的遗传突变，而针对这些致癌的遗传缺陷的靶向药物被证明在很多患者的初期治疗中是有作用的，然而耐药性随之而来，因为肿瘤拥有多种基因组缺失，其就可以帮助肿瘤细胞在药物疗法后产生一种耐药性。

来自德克萨斯大学MD安德森癌症中心的研究人员通过研究表示，利用免于免疫系统攻击癌症的药物同基因组靶向疗法相结合或许可以更好地帮助治疗癌症患者。

研究者指出，多种基因组靶向疗法的结合被证实可以有效抑制癌症，然而很多数据又显示，肿瘤基因组的多样性或许会打败许多组合疗法，而且随着不同药物对患者的施用也会增加更大的副作用。

靶向疗法或许可以扮演一种有效的癌症疫苗，其可以杀灭肿瘤细胞并且释放T细胞最喜爱的靶向抗原来对癌细胞实施打击。研究者的I期试验是将免疫检查点封锁药物同两种靶向疗法相结合，而后期研究者并没有足够的时间来确定个体的生存影响及机体反应的持久性。而在两项临床试验中，研究者将易普利姆玛同两种不同的BRAF抑制剂相结合来阐明联合疗法在治疗黑色素瘤中的作用，在其中一种疗法中肝脏的毒性导致试验终止，而另一种组合疗法随着试验的进行也表现出了较好的耐受性。

Le DT, Uram JN, Wang H, et al. PD-1 blockade in tumors with mismatch-repair def ciency. N Engl J Med. 2015;372(26):2509-2520.

启动免疫系统的新型PD-1相关抗癌药物对恶性黑色素瘤和肺癌取得了理想的临床效果，挽救了大量癌症患者的生命，但是这种药物对大肠癌没有效果。不过有一例大肠癌患者出现例外，2007年经过这种药物治疗后，转移性大肠癌肿瘤神奇消失，这引起科学家的极大兴趣。科学家们怀疑这种神奇效果可能是因为该患者肿瘤细胞的基因突变数量巨大。而这一小型临床研究提示，过去曾经认为对这种抗癌药物无效的肿瘤类型，只要存在DNA错配修复缺失，使用这种药物就可以取得理想的治疗效果。这意味着这种药物能对3-4%的癌患者产生效果。

研究人员在大肠癌和其他类型癌患者肿瘤组织中查找存在DNA错配修复基因突变的目标，这些患者因为对其他治疗无效而中断了治疗。然后他们将48名患者分成2组，1组存在这种基因突变，另1组不存在这种突变。全部患者都给予PD-1抑制剂pembrolizumab (Keytruda)治疗2周。

结果令人鼓舞，那些存在这种突变的患者大部分对治疗产生了非常好的反应，而没有这种突变的患者反应很少。25个缺乏这种突变的大肠癌患者中，没有一个有明显效果。存在这种突变的13个大肠癌患者中，8个发现肿瘤缩小，4个稳定，只有1个恶化。部分患者1年后仍然存活，而无反应的患者平均生存时间为7.6月。10名存在这种突变非大肠癌患者，包括胰腺、前列腺和子宫癌，7名肿瘤缩小或稳定，另外3名恶化。

Rizvi NA, Hellmann MD, Snyder A, et al. Cancer immunology.Mutational landscape determines sensitivity to PD-1 blockade in non-small cell lung cancer. Science. 2015;348(6230):124-128.

纪念斯隆凯特琳癌症中心的Timothy A. Chan博士继2014年在NEJM发病率一篇揭示黑色素瘤对免疫检查点抑制剂的响应，取决于肿瘤内是否有新抗原（基因突变），以及新抗原丰度的论文之后，又在非小细胞肺癌中发现了同样的现象，肿瘤内的新抗原会影响肿瘤对PD-1抗体治疗的响应情况。Chan博士的这两个发现，用一句话慨括就是，“患者肿瘤里预期的新抗原越多，响应治疗的可能性就越大。”

这两项研究的厉害之处在于，如果能让免疫系统识别更多的新抗原，就可以让免疫检查点抑制剂在更多的患者体内起作用。

Snyder A, Makarov V, Merghoub T, et al. Genetic basis for clinical response to CTLA-4 blockade in melanoma. N Engl J Med. 2014;371(23):2189-2199.

研究人员利用大规模并行测序，对来自于64例CTLA-4阻断剂治疗患者的恶性黑色素瘤外显子进行分析，确定了在黑色素瘤患者中可从CTLA-4阻断治疗中获益的遗传基础。

研究人员从接受Ipilimumab或tremelimumab治疗的黑色素瘤患者中获取肿瘤组织，对肿瘤进行全基因组外显子测序并与血样配对，对体细胞突变和来自于上述突变的候选新抗原加以确定，并且评估新抗原肽活化来自于ipilimumab经治患者淋巴细胞的能力。从中他们阐明了特异性存在于肿瘤之中并且对CTLA-4阻断治疗应答显著的新抗原标记，并且在接受抗CTLA-4抗体治疗的39例患者所组成第二组人群中验证了上述标记。

Yadav M, Jhunjhunwala S, Phung Q, et al. Predicting immunogenic tumour mutations by combining mass spectrometry and exome sequencing. Nature. 2014;515(7528):572-576.

研究人员采用联合外显子/转录组测序和质谱分析法，在MC－38和TRAMP－C1细胞系中分别检出28,439和10,118个点突变，而最终经验证具有免疫原性的肿瘤抗原表位仅仅只有3个和0个。

Van Allen EM, Miao D, Schilling B, et al. Genomic correlates of response to CTLA-4 blockade in metastatic melanoma. Science. 2015;350(6257):207-211.

来自美国Dana-Farber癌症研究院等处的研究人员发现一些能通过一种新型癌症免疫疗法得到治疗的转移性黑色素瘤患者，他们产生的肿瘤抗原并不同。这说明免疫疗法靶向的分子靶标可能因人而异，这意味着未来预测免疫疗法对患者的治疗效果，就难上加难了。

这种新治疗方法主要利用一种称为ipilimumab的药物，ipilimumab是一种单克隆抗体，作用为与CTLA-4结合并阻碍后者与其配体（CD80/CD86）的相互作用，因此阻断CTLA-4可增加T细胞的活化和增殖。美国FDA于2011年3月25日批准ipilimumab（商标名称为Yervoy）用于治疗晚期黑色素瘤。

这是一种相对较新的癌症治疗方法——免疫检查点抑制剂，抑制剂能帮助重新激活肿瘤中的免疫作用，从而开启机体天然屏障，杀死癌细胞。

以前的小型研究表明ipilimumab治疗疗效好的患者，他们的肿瘤出现了多个突变，这些突变产生大量作为免疫系统攻击对象的新抗原蛋白。而最新这些大型实验通过超过百位患者的肿瘤组织分析，发现出现大量肿瘤“新生抗原（neoantigen）”的患者，也就是对ipilimumab治疗疗效最好的患者。

微生物的作用

近年来一些研究发现了肠道微生物与免疫系统之间的密切联系，这为利用这种联系，通过选择性调节肠道细菌来改善免疫疗法提供了一条新途径。

Sivan A, Corrales L, Hubert N, et al.Commensal Bifidobacterium promotes antitumor immunity and facilitates anti-PD-L1 efficacy . Science. 2015;350(6264):1084-1089.

芝加哥大学的研究人员通过将一种特殊的细菌导入到黑色素瘤小鼠的消化道中，提高了小鼠免疫系统攻击肿瘤细胞的能力。这一效益与采用抗PD-L1抗体一类的检查点抑制剂进行治疗相差无几。

研究人员在Science杂志上报告称，联合给予口服剂量的细菌及注射抗PD-L1抗体几乎完全消除了肿瘤生长物。

研究负责人、芝加哥大学医学和病理学教授Thomas Gajewski博士说：“我们的研究结果明确证实了，特异的肠道细菌在增强免疫细胞对黑色素瘤及有可能许多其他类型肿瘤的反应上，发挥了一种出人意外但极为重要的作用。”

这项研究指出，小鼠实验证明双歧杆菌与抗肿瘤效果有关，而且只口服双歧杆菌，就能提高同剂量抗PD-L1治疗效果，在联合治疗中几乎完全抑制肿瘤生长。

Vetizou M, Pitt JM, Daillere R, et al. Anticancer immunotherapy by CTLA-4 blockade relies on the gut microbiota. Science. 2015;350(6264):1079-1084.

Ipilimumab是一种FDA批准的用于治疗晚期黑色素瘤的药物，通过靶向CTLA-4来抑制抗原激活的免疫应答反应，进而发挥抗肿瘤作用。这项研究发现肠道菌群中的拟杆菌属可控制Ipilimumab的抗癌效果。

研究人员发现机体肠道菌群的丰度越大、抗癌药物的效果也就越好。他们通过粪便微生物16S RNA的高通量测序以及qPCR鉴定出了肠道菌群中的拟杆菌属（Bacteroides）参与了Ipilimumab药物的抗癌效果，也进一步通过动物实验得到验证。而且为验证上述现象在人类癌症患者身上也同样发生，研究团队收集25名晚期黑色素瘤患者的样品，并进行肠道菌群的组成分析。结果发现Ipilimumab药物可使患者肠道微生物群落结构各异，且每种结构都由不同类的拟杆菌属来主导。

（生物通）