超灵敏纳米流式技术大力推动阿尔茨海默症和帕金森病的早期诊治

神经退行性疾病是一种大脑和脊髓细胞神经元丧失的疾病状态。神经退行性疾病以阿尔茨海默症(AD)和帕金森病(PD)的发病率最高，对中老年人健康危害最大。随着我国逐渐进入老龄化社会，AD和PD发病率逐年增高，目前已成为国内研究的重点疾病。然而，临床诊断的AD和PD患者病情大多已处于中晚期，现有的治疗手段均难以取得满意疗效。2011年美国国家衰老研究所指出，轻度认知障碍（MCI）应视为疾病的连续过程及脑脊液（CSF）生物标志物可作为早期的一项诊断指标。CSF生物标志物所提供的信息在疾病预测，早期诊治，病程的评估等方面具有重要价值。
 
CSF生物微颗粒的分子组成，已经在一些研究中被鉴定出来。然而，在这些研究当中，所涉及的每一种技术手段都有一定的局限性。例如，富集生物微颗粒的技术会对蛋白质和脂质之间的相互作用，蛋白质与蛋白质之间的相互作用产生影响。很多技术无法区分CSF中结合生物微颗粒的蛋白和没有结合生物微颗粒的蛋白。此外，在这些研究中，绝大数的方法都需要大量的CSF，这对于CSF作为生物标记物在临床检测中的应用是不现实的。
 
近来，流式细胞仪在分析小颗粒物质上展现出了诸多优势。在实践中，流式细胞仪已被广泛应用于阿尔兹海默症患者和正常人大脑突触体的研究。常规流式细胞仪能够检测的最小直径下限为0.5μm，在分析CSF生物微颗粒过程中会错过了0.1μm-0.5μm大小的微粒，当中又可能有着重要的生物标记，因此常规的流式细胞仪存在很多限制因素。随着技术的创新，英国Apogee公司开发出了超灵敏纳米流式细胞仪，已被欧洲国家计量研究协会评定为在微泡（<0.1μm）检测中最灵敏的系统。该系统超高的灵敏度，为CSF生物标志物的研究带来了极大的便利。

英国Apogee超灵敏纳米流式细胞仪

在前不久的研究中，Apogee A50 Micro已被Thomas J. Montine实验室成功应用于CSF生物标志物的分析检测，无疑将对AD和PD的早期诊治产生极大的推动作用。该研究利用Apogee A50 Micro，开发出了针对CSF生物颗粒定量，成份和大小鉴定的超高灵敏度检测方法，并且发现这些CSF生物微颗粒数据与大脑衰老以及常见的神经退行性疾病之间存在显着的关联性。研究人员通过检测Aβ42+，apoE+，apoAI+和apoJ+等CSF潜在生物标记物（图1和图2），发现在正常人的脑脊液中，apoAI+颗粒的含量会随着年龄的增加而升高，但是，在患有MCI，AD或PD的老年人CSF中却发现apoAI+微颗粒含量与在正常老年人相比明显偏低（图3）。这一重要发现，不仅意味着apoAI+微颗粒将会是神经退行性疾病早期诊断中一个重要生物标记物，也提示人们将来可以利用Apogee A50 Micro开展研究来寻找更多的CSF生物标记物。这些工作不仅能够大力推动AD和PD的早期诊断，也将对转化医学研究和寻找药物新靶点产生重要的理论意义和现实意义。
 

图1：人脑脊液中Aβ42+颗粒的流式分析
Fig.1: Flow cytometric analysis of β-amyloid (Aβ42)-positive particles in human CSF

图中，脑脊液（CSF）样品的荧光标记采用Aβ42-PE抗体标记。PBS缓冲液用同样的抗体标记，排除背景干扰。相同CSF样品用同型对照Isotype抗体标记，作为抗体的阴性对照。用Aβ42-PE抗体检测CSF Aβ42 pull down样品，以检测用Aβ42-PE抗体的特异性。

图2：人脑脊液中含载脂蛋白颗粒的流式分析
Fig.2: Flow cytometric analysis of CSF apolipoprotein-bearing particles in human CSF.

脑脊液样品分别采用apoE-Alexa Fluor 488, apoJ-Alexa Fluor 488, 和 apoAI-FITC抗体标记。PBS缓冲液用相同抗体标记，排除背景干扰。相同脑脊液样品用同型对照抗体Isotype标记，作为相应抗体的阴性对照。

图3:不同年龄正常人和老年病人脑脊液中apoAI+颗粒浓度
Fig.3: CSF apoAI-positive particle concentration in age and diagnostic groups

图中正常人脑脊液中，apoAI+颗粒的含量随着年龄的增加而升高。MCI，AD或PD的老年人CSF apoAI+颗粒与在正常老年人相比，含量显着下降。
 
参考文献：
Yang Y, Keene C D, et al. Cerebrospinal Fluid Particles in Alzheimer Disease and Parkinson Disease [J]. Journal of Neuropathology & Experimental Neurology, 2015, 74(7): 672-687.