减少CRISPR-Cas9脱靶效应的新方法

　　

生物通报道：RNA引导的Cas9核酸酶，被广泛用来设计各种细胞和生物的基因组。尽管Cas9能够诱导有效的突变发生，但是脱靶效应提高了人们对于系统特异性的担忧。最近，有研究人员开发出了一种 “双切口（double-nicking）”策略，利用催化突变体Cas9D10A切口酶，将脱靶效应降至最低。4月15日，在Nature子刊《Scientific Reports》发表的一项研究中，来自英国剑桥大学和惠康基金会桑格研究所的研究人员，描述了一种基于Cas9D10A的筛查方法，将一种一体化的Cas9D10A切口酶载体与荧光激活的细胞分选富集相结合，随后是高通量的基因型和表型克隆筛选策略，可高效地生成同基因敲除和敲入，同时具有最低的脱靶效应。

CRISPR-Cas系统在细菌和古细菌的适应性免疫中发挥作用，以攻击入侵的外来遗传因子。最近，酿脓链球菌2型CRISPR-Cas9系统，已被用来通过诱导DNA双链断裂（DSBs）进行基因组工程，DSBs可通过非同源末端连接（NHEJ）或同源引导的修复（HDR）而得以修复。诱变NHEJ能够在修复位点诱导插入或缺失，这可能会导致开放阅读框的移码突变，从而产生截短体蛋白和在mRNA中产生过早成熟的停止密码子，这是无义介导的mRNA降解的一个关键诱导物。

另外，HDR允许精确的基因敲入遗传修饰，如点突变、插入和表位标记。CRISPR-Cas9系统可有效地生成基因组修饰，仅仅依靠一个PAM和一个与靶基因互补的sgRNA。然而，sgRNA可能经常被设计为对靶位点有很高的特异性（在大的基因组，如哺乳动物基因组），通常相关序列包含一个或多个与sgRNA不匹配的基因，从而会产生潜在不良的脱靶效应。事实上，越来越多的证据表明，这样的脱靶效应可能会影响最终实验结果，并限制了CRISPR-Cas9的效用，特别是在临床设置中。

最近的研究表明，CRISPR-Cas9脱靶效应可能由几种方法诱导，包括利用缩短的sgRNAs、FokI-Cas9融合核酸酶、纯化的Cas9核糖核蛋白、修改的sgRNAs或配对的催化突变Cas9切口酶。虽然这些方法当中有几种方法能达到较低的脱靶效应，但代价是，会降低打靶效率。延伸阅读：检测CRISPR/Cas9脱靶效应的简单方法；Cell子刊：定量基因组编辑的脱靶和打靶效应；NIBS张昱《Cell Res》解析CRISPR/Cas9脱靶效应。

有很多研究都集中在Cas9切口酶（RuvCD10A或HNHH840A），不同于野生型Cas9——会产生迟钝的DSBs，它们只切割DNA的一条链，产生可被如实修复的单链断裂（SSB），而不会诱导插入和缺失。为了产生DSBs，最近有研究开发了一种双切口策略，包括靶定相邻区域的配对切口酶，从而意味着脱靶DSBs的可能性减至了最小化。然而，多个质粒的共转让，包括一个Cas9切口酶、两个sgRNA和一个荧光标记，可能会影响转染效率和定向诱变，因此，到目前为止，这种方法的广泛使用受到了限制。

在这项研究中，研究人员描述了一种基于Cas9D10A的筛查方法，将一种一体化的Cas9D10A切口酶载体与荧光激活的细胞分选富集结合，随后是高通量的基因型和表型克隆筛选策略，可高效地生成同基因敲除和敲入，同时具有最低的脱靶效应。研究人员在三种不同的人细胞系中，通过靶定DNA损伤反应（DDR）蛋白MDC1、53BP1、RIF1和P53，以及核架构蛋白Lamin A/C的基因，验证了这种方法。

研究人员还利用单链寡脱氧核苷酸作为同源模板，有效地获得了双等位基因敲入克隆，在RIF1位点插入了一个EcoRI识别位点，并在组蛋白H2AFX位点引入一个点突变，以抑制DDR因子在DNA双链断裂位点的组装。这种通用的筛查方法，应该有助于旨在确定基因功能、模拟癌症和其他疾病的研究，并探索新的治疗机会。

（生物通：王英）

生物通推荐原文摘要：
CRISPR-Cas9D10A nickase-based genotypic and phenotypic screening to enhance genome editing
Abstract: The RNA-guided Cas9 nuclease is being widely employed to engineer the genomes of various cells and organisms. Despite the efficient mutagenesis induced by Cas9, off-target effects have raised concerns over the system’s specificity. Recently a “double-nicking” strategy using catalytic mutant Cas9D10A nickase has been developed to minimise off-target effects. Here, we describe a Cas9D10A-based screening approach that combines an All-in-One Cas9D10A nickase vector with fluorescence-activated cell sorting enrichment followed by high-throughput genotypic and phenotypic clonal screening strategies to generate isogenic knockouts and knock-ins highly efficiently, with minimal off-target effects. We validated this approach by targeting genes for the DNA-damage response (DDR) proteins MDC1, 53BP1, RIF1 and P53, plus the nuclear architecture proteins Lamin A/C, in three different human cell lines. We also efficiently obtained biallelic knock-in clones, using single-stranded oligodeoxynucleotides as homologous templates, for insertion of an EcoRI recognition site at the RIF1 locus and introduction of a point mutation at the histone H2AFX locus to abolish assembly of DDR factors at sites of DNA double-strand breaks. This versatile screening approach should facilitate research aimed at defining gene functions, modelling of cancers and other diseases underpinned by genetic factors, and exploring new therapeutic opportunities.