中国农业大学：利用CRISPR/Cas9构建转基因绵羊

　　

生物通报道  来自中国农业大学、中国农业科学院、暨南大学的研究人员报告称，他们利用CRISPR-Cas9系统成功生成了携带报告基因的基因敲入转基因绵羊。这一研究成果发布在4月11日的《Scientific Reports》杂志上。

中国农业大学的王楚端(Chuduan Wang)教授，中国农业科学院的杜立新(Lixin Du)教授，暨南大学的王晓刚(Xiaogang Wang)副研究员是这篇论文的共同通讯作者。

绵羊（Sheep）是一种重要的经济动物，生产性状已成为了绵羊育种的主要方向。特异组织或细胞类型表达报告基因的转基因动物是有价值的实验工具。

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CRISPR/Cas9技术是一种新型的基因组定点编辑技术,具有设计简单、特异性强、效率高及可以在目标位点产生多种类型的编辑结果等特点,适用于在多种细胞中进行大规模的基因编辑。在转基因动物中具有明显的应用优势和良好前景。这一系统已被成功用来靶向包括小鼠、大鼠、斑马鱼和猪在内的几个物种的基因组位点。

2015年，中国农业科学院北京畜牧兽医研究所的李奎教授领导研究团队，首次结合CRISPR/Cas9与体细胞核移植技术获得了位点特异性的基因敲入猪模型。这一突破性成果发表在九月十八日的Scientific Reports杂志上（农科院李奎教授用CRISPR成功构建转基因猪 ）。

2015年9月，来自西北农林科技大学、榆林学院、南京大学和上海科技大学等处的研究人员，通过将靶定MSTN和FGF5基因的Cas9 mRNA和sgRNA，向单细胞阶段受精卵的共注射，成功制备了一个或两个基因修饰的转基因山羊（我科学家用CRISPR获得转基因山羊）。

2015年11月，来自吉林大学的研究人员报告称，他们利用CRISPR/Cas9系统高效构建出了myostatin (MSTN)基因突变猪。这一研究成果发布Scientific Reports杂志上（吉林大学：利用CRISPR/Cas9构建转基因猪 ）。

然而到目前为止，尚未有研究报道利用CRISPR/Cas9在绵羊基因组中介导基因插入DNA基因盒。

Rosa26基因可以在几乎所有的生物体中编码一种非必需的核RNA，因而成为了外源基因插入的一个热点。在这篇新文章中，研究人员描述利用一种携带tGFP序列的供体载体，在绵羊基因组Rosa26位点精确、有效地实现了CRISPR/Cas9介导的靶向性插入。他们成功地以高效率将外源性tGFP (turboGFP)基因整合到了靶基因中。

由于其简单、设计灵活且高效，作者们提出CRISPR/Cas9介导的基因敲入将成为构建转基因绵羊的一种标准方法。

（生物通：何嫱）

生物通推荐原文摘要：

Rosa26-targeted sheep gene knock-in via CRISPR-Cas9 system

Recent advances in our ability to design DNA binding factors with specificity for desired sequences have resulted in a revolution in genetic engineering, enabling directed changes to the genome to be made relatively easily. Technologies that facilitate specific and precise genome editing, such as knock-in, are critical for determining the functions of genes and for understanding fundamental biological processes. The CRISPR/Cas9 system has recently emerged as a powerful tool for functional genomic studies in mammals. Rosa26 gene can encode a non-essential nuclear RNA in almost all organizations, and become a hot point of exogenous gene insertion. Here, we describe efficient, precise CRISPR/Cas9-mediated Integration using a donor vector with tGFP sequence targeted in the sheep genomic Rosa26 locus. We succeeded in integrating with high efficiency an exogenous tGFP (turboGFP) gene into targeted genes in frame. Due to its simplicity, design flexibility, and high efficiency, we propose that CRISPR/Cas9-mediated knock-in will become a standard method for the generation transgenic sheep.

作者简介：

王楚端:中国农业大学动物科学技术学院教授。研究方向为猪育种规划、肉质、规模化养猪生产。从1990年以来从事猪育种方案的理论研究与实践工作，应用系统工程方法，建立了中国猪育种规划最优化系统，应用这一系统深入研究了影响猪育种成效的诸因素作用机制。在国内外专业刊物发表30余篇论文。

杜立新，男，1956年6月生，博士，博士生导师，教授，中国农业科学院畜牧研究所科技创新一级岗位，羊遗传育种室主任，中国农业科学院二级岗位杰出人才，国家畜禽分子遗传育种中心教授，享受国家政府特殊津贴待遇。近年来获得荣誉：山东省优秀科技工作者；享受国务院政府特殊津贴。

王晓刚：男 ,暨南大学生命科学技术学院副研究员、硕导。研究方向：主要从事非编码RNA基础与应用研究工作