Lenti-X™ Tet-On® 3G CRISPR/Cas9 System，不必再担忧慢病毒的整合性

通过慢病毒导入sgRNA和Cas9基因，可以轻松实现难转染细胞系的CRISPR/Cas9基因编辑，但是慢病毒的整合特性，可能会造成Cas9的恒定表达。2016年Takara旗下Clontech新推出的Lenti-X™ Tet-On® 3G CRISPR/Cas9 System，结合Tet-On 3G 反式转录激活蛋白质，有效规避了这一担忧，通过添加多西霉素（doxycycline）控制Cas9的表达，减少因Cas9恒定表达可能造成的毒性与脱靶效应。

CRISPRs/Cas9 技术是基因组编辑领域重要的突破。在Cas9与sgRNA的共同作用下，定点基因组改变的难度显著降低，而且可进行操作的目标生物种类大大增加。Takara旗下Clontech的Guide-It产品线，全面优化了目前CRISPRs/Cas9的操作步骤，为成功的基因编辑实验保驾护航。

对于一些难转染的细胞系，借助慢病毒包装的方法导入sgRNA和Cas9基因，进而实现靶向基因编辑。但是慢病毒的整合特性，可能会造成Cas9的恒定表达。2016年，Takara旗下Clontech新推出的Lenti-X™ Tet-On® 3G CRISPR/Cas9 System，结合Tet-On 3G 反式转录激活蛋白质，有效规避了这一担忧，通过添加多西霉素（doxycycline）控制Cas9的表达，减少可能造成的毒性与脱靶效应。

 
Lenti-X CRISPR/Cas9 System是一个完整的由慢病毒介导的CRISPR/Cas9基因编辑系统。该系统包括Lenti-X Packaging Single Shots（用于产生高滴度的病毒）和三个不同的质粒载体（用于在靶细胞中表达Cas9、客户自定义的sgRNA和Tet-On 3G 反式转录激活蛋白质）。表达sgRNA的质粒系统pLVX-hyg-sgRNA1，易于插入客户自定义的sgRNA 序列，并且该系统提供足够的质粒供客户构建10种不同的sgRNA序列质粒。Tet-On 3G 反式转录激活蛋白质，这使得用户可以通过添加多西霉素（doxycycline）来诱导Cas9的表达。通过严格控制Cas9的表达，Lenti-X Tet-On 3G CRISPR/Cas9 System可以使用户在细胞培养中，减少与Cas9恒定表达相关的毒性与脱靶效应。

 
Vector components for Lenti-X Tet-On 3G CRISPR/Cas9 System.

pLVX-EF1a-Tet3G encodes the Tet-On 3G transactivator protein under the control of the constitutive EF-1 alpha promoter. In contrast with the commonly used CMV promoter, EF-1 alpha is less susceptible to silencing by certain cell types (including various types of stem cells), enabling the establishment of inducible cell lines that are suitable for long-term use. Tet-On 3G is a modified form of the Tet-On Advanced transactivator protein, which was evolved to have a far higher sensitivity to doxycycline. pLVX-TRE3G-Cas9-puro encodes a modified version of the Cas9 endonuclease under the control of the inducible PTRE3GV promoter. The Cas9 sequence in pLVX-TRE3G-Cas9-puro was originally derived from the bacterium S. pyogenes, and has been codon optimized for expression in mammalian cells. Additional Cas9 modifications include the incorporation of a C-terminal nuclear localization signal (NLS). pLVX-hyg-sgRNA1 encodes an sgRNA (designed and inserted by the user) under the constitutive human U6 promoter.

（文中涉及图片均来源于Takara Bio USA, Inc.）

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http://www.clontech.com/CN/Products/Genome_Editing/CRISPR_Cas9/lentiviral_systems?sitex=10022:22372:US