赖良学教授课题组用CRISPR制备外胚层发育不良猪模型

　　

生物通报道：脱发和头发稀疏给许多患者造成了很大困扰。外胚层发育不良-9（ED-9）是一种先天性疾病，其特征是头发和指甲营养不良，而无其他疾病，HOXC13是ED-9的一个致病基因。然而，携带Hoxc13突变的小鼠也发展出其他严重的疾病，如骨骼缺陷、逐渐消瘦、存活力低。但是，小鼠模型并不能忠实地模拟人类ED-9。现在，来自中科院广州生物医药与健康研究院和南方医科大学南方医院的研究人员，通过单链寡核苷酸结合CRISPR/Cas9和体细胞核移植，制备了一个ED-9猪模型。相关研究结果发表在12月22日的《Human Molecular Genetics》杂志。

中科院广州生物医药与健康研究院的赖良学（Liangxue Lai）研究员及其课题组的樊娜娜（Nana Fan）博士，和南方医科大学南方医院的曾抗（Kang Zeng）教授，是本文共同通讯作者。赖良学教授近两年发表了多项重要研究成果，例如：赖良学团队获得重症联合免疫缺陷小型猪模型；赖良学教授连发CRISPR研究成果；赖良学教授再发两项CRISPR成果。

无论是先天因素还是后天因素引起的脱发和头发稀疏，都给患者带来了很大困扰。其中，外胚层发育不良-9（ED-9）是一种遗传性疾病，其特点是头发和指甲营养不良，但其他外胚层和非外胚层组织没有疾病。

1998年Godwin等人，通过破坏Hoxc13的DNA结合同源域，制备了Hoxc13基因敲除（Hoxc13−/−）小鼠，来验证Hoxc13在发育中的作用，并制备了一种ED-9动物模型。除了头发稀疏和指甲畸形之外，研究人员在Hoxc13−/−小鼠中还观察到了骨缺损、逐渐消瘦和乏力。这些小鼠大部分在出生后7到14天死亡，其存活力只有10%。显然，相比较人类而言，Hoxc13在小鼠中具有更广泛的功能，小鼠中的Hoxc13突变未能忠实地模拟人类ED-9。

啮齿类动物模型通常被用来阐明基因功能，并研究人类疾病的分子基础和病理学。然而，最近的研究表明，因为小鼠和人类的差异，小鼠模型在各个方面都不能完全复制人类疾病的表型，如生理性状和基因表达。啮齿类动物的皮肤与皮下结缔组织紧密相连，与人的皮肤有明显区别。此外，生物医学已经发展到转化医学的阶段。小鼠的短寿命和小体型，会妨碍长期研究的安全性和效率，因此迫切需要使用大型的动物模型。

在模拟人类疾病方面，猪被认为是比小鼠更好的动物模型，因为猪和人之间的相似性更高。猪和人的皮肤的一般结构在皮肤层厚度、真皮-表皮界面、细胞外基质、毛囊含量、色素沉着和血液供应等方面都有显著的相似性。

在这项研究中，研究人员采用单链寡核苷酸（ssODNs）结合CRISPR/Cas9和体细胞核移植，通过在猪中复制人类Hoxc13的点突变，制备了一个Hoxc13基因敲除猪模型。在人类和小鼠中，由Hoxc13突变引起的表型，在猪模型中也得以确认。复制人类ED-9的猪模型可用于发病机理的研究，并作用一种有效的无毛模型，用于毛发再生研究和其他皮肤病研究。

（生物通：王英）

注：赖良学，中国科学院广州生物医药与健康研究院研究员，吉林大学畜牧兽医学院院长/教授，博士生导师，华南干细胞与再生医学研究所副所长。主要研究领域：人和动物胚胎干细胞的分离培养、转基因动物的建立、动物克隆及人类治疗性克隆、体外受精及其影响因素。赖良学博士在美国密苏里大学动物中心实验室采用基因敲除技术首次实现了人类培育“基因敲除”克隆猪，科学界普遍认为“这是向异种器官移植迈出的关键一步”，为人类的器官移植开辟了新天地。先后在《Science》、《Nature Biotechnology》等国际影响力期刊上发表论文多篇，获得国家级、省级专利多项。

生物通推荐原文摘要：
Generation of Hoxc13 knockout pigs recapitulates human ectodermal dysplasia–9
Abstract：Atrichia and sparse hair phenotype cause distress to many patients. Ectodermal dysplasia–9 (ED–9) is a congenital condition characterized by hypotrichosis and nail dystrophy without other disorders, and Hoxc13 is a pathogenic gene for ED–9. However, mice carrying Hoxc13 mutation present several other serious disorders, such as skeletal defects, progressive weight loss, and low viability. Mouse models cannot faithfully mimic human ED–9. In this study, we generated an ED–9 pig model via Hoxc13 gene knockout through single-stranded oligonucleotides (c.396C>A) combined with Crispr/Cas9 and somatic cell nuclear transfer. Eight cloned piglets with three types of biallelic mutations (five piglets with Hoxc13c.396C>A /c.396C>A, two piglets with Hoxc13c.396C>A /c.396C>A+1, and one piglet with Hoxc13Δ40/Δ40) were obtained. Hoxc13 was not expressed in pigs with all three mutation types, and the expression levels of Hoxc13-regulated genes, namely, Foxn1, Krt85, and Krt35, were decreased. The hair follicles displayed various abnormal phenotypes, such as reduced number of follicles and disarrayed hair follicle cable without normal hair all over the body. By contrast, the skin structure, skeleton phenotype, body weight gain and growth of Hoxc13 knockout pigs were apparently normal. The phenotypes of Hoxc13 mutation in pigs were similar to those in ED– patients. Therefore, Hoxc13 knockout pigs could be utilized as a model for ED–9 pathogenesis and as a hairless model for hair regeneration research. Moreover, the hairless pigs without other major abnormal phenotypes generated in this study could be effective models for other dermatological research because of the similarity between pig and human skins.