Nature Methods发表论文报道5-醛基胞嘧啶测序新技术

　　

     2015年9月7日，北京大学生命科学学院伊成器研究组在《Nature Methods》杂志在线发表题为“Bisulfite-free, base-resolution analysis of 5-formylcytosine at the genome scale”的研究论文（DOI: 10.1038/nmeth.3569）。文章报道了一种通过化学标记和富集手段，首次实现了免亚硫酸氢盐处理（bisulfite-free）的5-醛基胞嘧啶（5fC）单碱基分辨率、全基因组水平测序。
 
      5-甲基胞嘧啶修饰（5mC）是真核细胞基因组中最为重要的表观遗传修饰之一。5mC可以在TET家族酶的作用下，逐步氧化生成5-羟甲基胞嘧啶（5hmC）、5-醛基胞嘧啶（5fC）和5-羧基胞嘧啶（5caC）；后两者也可以被TDG糖基化酶所识别并切除。对于上述几种新型DNA修饰的功能研究是目前核酸表观遗传学的一个研究热点。而其中一个主要的难题，就是如何实现5fC等核酸修饰在基因组中的精准定位。
 

fC-CET检测全基因组5-醛基胞嘧啶修饰谱图

（a）化合物AI标记5-醛基胞嘧啶；（b）fC-CET流程图；（c，d）5-羟甲基胞嘧啶（c）及5-醛基胞嘧啶（d）标记位点胞嘧啶的表观遗传修饰情况，显示5fC标记的位点整体甲基化比例极低。
 
      科学家们之前已经发展了基于抗体和亚硫酸氢盐的5fC测序技术。依赖抗体的测序技术通常分别率较低；而依赖亚硫酸氢盐处理的5fC测序技术，虽然能够实现单碱基分别率的5fC检测，但亚硫酸氢盐处理产生严重的DNA降解、且测序成本昂贵。本项研究的团队通过化学生物学的手段，利用一种小分子化合物对5fC的特异性化学标记，发展了不依赖于亚硫酸氢盐处理的5fC单碱基分辨率测序技术：fC-CET （Cyclization-Enabled C-to-T Transition of 5fC）。利用这一技术，该研究成功实现了小鼠胚胎干细胞中5fC的谱图鉴定，同时发现5fC富集的区域比5hmC富集的区域更为活跃。由于这一技术不对基因组DNA造成明显降解，fC-CET也将适用于小量、珍贵核酸样本的分析与测序。
 
      芝加哥大学化学系的何川教授共同指导了该项研究，伊成器研究员和何川教授是该论文的通讯作者。在这项研究中，伊成器实验室本科生夏波（现在纽约大学医学院攻读博士）发挥了关键作用，夏波与芝加哥大学博士韩大力、博士生陆星宇是这篇论文的共同第一作者。清华大学颉伟课题组为该项研究提供了建库方面的技术支持。该研究得到了国家自然科学基金、科技部973计划和北大清华生命科学联合中心的资助。

原文摘要：

Bisulfite-free, base-resolution analysis of 5-formylcytosine at the genome scale

Active DNA demethylation in mammals involves oxidation of 5-methylcytosine (5mC) to 5-hydroxymethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5fC) and 5-carboxylcytosine (5caC). However, genome-wide detection of 5fC at single-base resolution remains challenging. Here we present fC-CET, a bisulfite-free method for whole-genome analysis of 5fC based on selective chemical labeling of 5fC and subsequent C-to-T transition during PCR. Base-resolution 5fC maps showed limited overlap with 5hmC, with 5fC-marked regions more active than 5hmC-marked ones.