中科院动物所发表CRISPR新成果

　　

生物通报道：CRISPR/Cas9用一个单导向RNA（sgRNA），来产生位点特异性的DNA断裂，随着这项技术的出现，大大增强了家畜的遗传工程。然而，sgRNA活性的巨大差异所带来的不确定性，妨碍了这一系统制备转基因猪的效用。八月二十一日，来自中科院动物研究所、四川农业大学和中国农科院等处的研究人员，在Nature子刊《Scientific Reports》发表一项研究，描述了一种单胚泡基因分型系统，可提供一种简单而快速的方案，来评估和比较sgRNA在一个给定基因位点诱导插入突变的效率。中科院动物研究所的赵建国和周琪两位研究员、以及四川农业大学动物医学院的曹随忠教授，是本文的共同通讯作者。延伸阅读：院士增选初步候选人名单 张学军，周琪上榜。

猪是人类重要的食物和营养来源，被广泛用于研究各种人类疾病。对猪进行高效和精确的基因改造，将有助于产生个性化的疾病模型和有宝贵农业性状的品系。然而，尽管有大量的技术可用，如显微注射、精子介导转染、卵母细胞的转导和卵胞浆内单精子注射（ICSI）介导的转基因，通过同源重组产生转基因猪，仍然是一个比较费时的过程。

体细胞核转移（SCNT）可绕过以上技术的大部分缺点，从而有助于制备基因组修饰猪。但是，SCNT效率低，由于缺乏可用的、有生殖细胞能力的多能干细胞，因此要建立具有理想遗传修饰的细胞系，这阻碍了这项技术的应用。有几种基因组工程技术已被开发并用于引导核酸酶在基因组中诱导位点特异性双链断裂（DSBs），从而使研究人员能够有效地产生转基因猪。最近开发的II型CRISPR/ Cas系统，最近已被开发并用于基因组编辑。这一CRISPR/Cas9系统已被成功地用于产生转基因动物，包括小鼠、大鼠、斑马鱼、青蛙、果蝇、猴子和家畜。

最近，有研究证明，CRISPR/Cas9系统，直接通过Cas9 mRNA的细胞质注射和将sgRNA注入猪的受精卵，可有效地生成双等位基因敲除猪。这表明，CRISPR/Cas9系统显示出用于复杂的猪基因组工程的潜力。然而，由于漫长的妊娠期和圈养高成本，在一次实际实验完成后利用来自胎儿或新生仔猪的染色质样本，来确明在修饰的猪基因组的靶序列中存在插入缺失突变，是具有挑战性的。此外，要获得足够数量的体内衍生受精卵，就必需密集劳动和众多母猪。因此，一种优化的CRISPR/Cas9基因工程猪系统，可以最大限度地发挥遗传修饰的效率。

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虽然sgRNA活性可能是相当高的，但是sgRNA在其产生无效等位基因的能力方面，有着显著的可变性，并且sgRNA靶向效率在位点之间、甚至在同一基因座的靶位点之间存在显著差异。为了精确的遗传修饰（敲入或碱基替换），相比较一般的基因缺失而言，sgRNA的靶向效率是最关键的因素。因此，为一个特定基因座选择最有效的sgRNA，将极大地扩展猪CRISPR/Cas9系统的效用。

在这项研究中，研究人员描述了一种单胚泡基因分型系统，可提供一种简单、快速的解决方案，来评估和比较sgRNA诱导一个给定基因座中插入缺失突变的效率。评估sgRNA的诱变效率，可以在从sgRNA设计的10天内完成。这个系统所选择的最有效的sgRNA，可通过同源指导修复，以超过13%的频率，成功用来诱导位点特异性插入。

此外，研究人员在猪成纤维细胞（可作为体细胞核移植的供体细胞）中证实，通过选择的sgRNA可高效的进行基因删除。该研究进一步表明，Cas9 mRNA的直接细胞质注射，以及有利的sgRNA注入受精卵，可以高达100%的效率，产生双等位基因敲除猪。因此，这种方法大大降低了不确定性，并扩展了基因组工程在家畜中的实际可能性。

（生物通：王英）
注：赵建国研究员是中科院动物所“****”引进海外杰出人才，2003年博士毕业于东北农业大学，2003年至2005年在上海交通大学医学遗传研究所任助理研究员，2005年至2007年在美国新奥尔良大学从事博士后研究，2007年至2010年在美国密苏里大学哥伦比亚分校任研究助理教授。主要研究方向为通过分子诱变或体细胞核移植转基因技术策略来改善猪的农业生产性状或构建用于生物医学研究为目的的转基因动物模型。

周琪研究员是中科院动物研究所副所长，1996年博士毕业于东北农业大学，1997年进入中科院发育生物学研究所从事博士后研究，1999年在中科院发育生物学研究所获副研究员任职资格，1999年至2002年，在法国国家农业研究中心分子发育生物学部从事博士后研究，2001年入选中科院“****”。在2015年八月份发布的院士增选初步候选人名单中，周琪研究员榜上有名。

生物通推荐原文摘要：
Efficient CRISPR/Cas9-mediated biallelic gene disruption and site-specific knockin after rapid selection of highly active sgRNAs in pigs
Abstract: Genetic engineering in livestock was greatly enhanced by the emergence of clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated 9 (Cas9), which can be programmed with a single-guide RNA (sgRNA) to generate site-specific DNA breaks. However, the uncertainties caused by wide variations in sgRNA activity impede the utility of this system in generating genetically modified pigs. Here, we described a single blastocyst genotyping system to provide a simple and rapid solution to evaluate and compare the sgRNA efficiency at inducing indel mutations for a given gene locus. Assessment of sgRNA mutagenesis efficiencies can be achieved within 10 days from the design of the sgRNA. The most effective sgRNA selected by this system was successfully used to induce site-specific insertion through homology-directed repair at a frequency exceeding 13%. Additionally, the highly efficient gene deletion via the selected sgRNA was confirmed in pig fibroblast cells, which could serve as donor cells for somatic cell nuclear transfer. We further showed that direct cytoplasmic injection of Cas9 mRNA and the favorable sgRNA into zygotes could generate biallelic knockout piglets with an efficiency of up to 100%. Thus, our method considerably reduces the uncertainties and expands the practical possibilities of CRISPR/Cas9-mediated genome engineering in pigs.