用CRISPR/斑马鱼实现大规模基因打靶

　　

生物通报道：最近，美国国立卫生研究院（NIH）人类基因组研究所（NHGRI）开展的一项研究表明，一种相对较新、靶定斑马鱼中特定DNA序列的方法，可大大加快基因功能的发现和人类疾病相关基因的识别。相关研究结果发表在六月五日的国际基因组研究权威期刊《Genome Research》。延伸阅读：苏州大学利用TALEN技术研究斑马鱼生物钟。

在这项研究中，研究人员报道称，目前风靡科学界的CRISPR/Cas9基因编辑技术，可以高于其他技术六倍的效率，靶定基因和插入或删除特定序列。该研究还表明，CRISPR/Cas9方法可以一种“多路复用”的方式使用，就是说，同时靶定和突变多个基因，以确定它们的功能。

NHGRI转化和功能基因组学部门高级研究员、发育基因组学部门主任Shawn Burgess博士指出，在大约一年前有研究表明，CRISPR可以很快地敲除一个基因。我们所做的是，建立一套完整的流程，在脊椎动物模型中快速敲除多个基因，并检测它们的功能。研究人员经常通过敲除一个基因——关闭或删除它，并观察对缺乏这个基因的生物体有何潜在影响——来确定它的作用。

在动物模型中进行这种较大规模——被称为“高通量”——的基因打靶，对于人类基因组研究可能是特别有用的。Burgess博士说，在已确定的人类基因中，只有10%到20%的基因经过了这种严格的测试。其他许多基因的功能，都是基于蛋白质分析推测出来的，或已被确定为可能的致病基因，但还没有通过在动物模型中敲除这些基因并观察发生了什么，来确证它们的功能。Burgess认为，这种方法可在一个更具成本效益的大规模上，做到这一点。

NHGRI主任Eric Green 博士称，斑马鱼研究已经加快了我们对于癌症和其他人类疾病的认识。我们预期，NHGRI研究人员所开发的这项技术，将加速我们了解特定基因的生物学功能，以及它们在人类遗传疾病中所发挥的作用。

CRISPR/Cas9基因编辑方法，是NHGRI研究团队这种高通量方法的两个关键要素之一。CRISPR/Cas9，仿照细菌演化出来的一种病毒抵御机制，在2012第一次被提出。自那时以来，它已经迅速传播并用于美国及其他国家的基因组研究实验室。CRISPR缩写代表“成簇的、规律间隔的短回文重复序列”，指的是常出现在细菌DNA中的一种DNA序列模式。科学家认为，CRISPR序列反映了对过去病毒攻击的进化反应。Cas9蛋白是一种核酸酶，这种酶可在两个地方剪掉一段DNA片段，实际上就是切下一块。总之，CRISPR/Cas9是一种强有力的研究工具，可让研究人员靶定和删除一段特定的序列，或向模型动物胚胎的DNA中插入一段新的序列。

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NHGRI研究团队这种方法的另一个重要组成部分是斑马鱼（Danio rerio）。斑马鱼和小鼠是研究最常用的实验脊椎动物，它们的基因组已被完全测序。斑马鱼更适合于较大规模的基因编辑，因为大约70%的斑马鱼基因似乎都有人类对应物，而且养鱼的成本远远低于小鼠。它们以惊人的速度繁殖；雌性可同时产生多达200个卵。胚胎是体外受精，而且都是透明的，从而方便研究人员观察。

为了证明高通量基因编辑的可行性，研究人员靶定了83个斑马鱼基因中的162个位置，其中大约50个基因类似于人类耳聋相关基因。（听力是Burgess实验室的一个研究兴趣点）。这在83个基因中产生了82个突变。

研究人员用荧光聚合酶链反应（一种技术，可让研究人员产生一段特定DNA序列的数以百万计个拷贝）筛选胚胎，并进行了高通量DNA测序，他们发现，总体而言，在28%的案例中，突变被传递给下一代。研究人员报道称，一些基因比其他基因的传递率更高，但在大多数情况下，筛选来自亲本鱼的后代，应该足以发现大多数突变。

结果表明，在斑马鱼中利用CRISPR/Cas9技术，将有可能产生斑马鱼基因组中所有基因的突变体，并进行“大规模的表型分析”。

CRISPR/Cas9方法在小鼠中也起作用，但是太昂贵，而且需要更长的时间。虽然小鼠实际上早于斑马鱼达到性成熟，但是它们产生的后代更少。

最终，Burgess望他的实验室将使用新的方法，敲除斑马鱼大约25,000个基因中的10%，他希望看到更广泛的努力。Burgess表示，我们已经表明，你可以用相对适度的资源，分析数百个基因。在大科学的规模上，你能用相对较低的科学投入，靶定基因组中的每个基因。

（生物通：王英）

生物通推荐原文摘要：
High-throughput gene targeting and phenotyping in zebrafish using CRISPR/Cas9
Abstract: The use of CRISPR/Cas9 as a genome-editing tool in various model organisms has radically changed targeted mutagenesis. Here, we present a high-throughput targeted mutagenesis pipeline using CRISPR/Cas9 technology in zebrafish that will make possible both saturation mutagenesis of the genome and large-scale phenotyping efforts. We describe a cloning-free single-guide RNA (sgRNA) synthesis, coupled with streamlined mutant identification methods utilizing fluorescent PCR and multiplexed, high-throughput sequencing. We report germline transmission data from 162 loci targeting 83 genes in the zebrafish genome, in which we obtained a 99% success rate for generating mutations and an average germline transmission rate of 28%. We verified 678 unique alleles from 58 genes by high-throughput sequencing. We demonstrate that our method can be used for efficient multiplexed gene targeting. We also demonstrate that phenotyping can be done in the F1 generation by inbreeding two injected founder fish, significantly reducing animal husbandry and time. This study compares germline transmission data from CRISPR/Cas9 with those of TALENs and ZFNs and shows that efficiency of CRISPR/Cas9 is sixfold more efficient than other techniques. We show that the majority of published “rules” for efficient sgRNA design do not effectively predict germline transmission rates in zebrafish, with the exception of a GG or GA dinucleotide genomic match at the 5′ end of the sgRNA. Finally, we show that predicted off-target mutagenesis is of low concern for in vivo genetic studies.