流式细胞技术新工具：PCR+流式分析

　　

生物通报道：流式细胞技术与相关的荧光激活细胞分选技术（fluorescence-activated cell sorter，FACS）对生物学研究产生了深远的影响，但是它们还是存在一些局限性，近年来，科学家们研发出了一些新的策略，但他们并没有修改传统的流式细胞仪，而是在新型微流控装置上进行精简。这些微型芯片实验室能帮助研究人员在更为多样的物理和分子特征基础上进行筛选和分型，而且也不需要抗体。以下是几位学者提出的新型流失细胞技术与研究策略。

PCR激活分拣

研究人员：加州大学旧金山分校生物工程与治疗生物学助理教授Adam Abate

当前项目：分析罕见的自养型微生物

存在问题：针对无法培养细菌的特殊抗体

解决方案：

Abate在哈佛大学工程与应用科学学院的著名教授David A. Weitz实验室从事博士后研究工作，后者是国际上生物物理与生物材料、微流控等研究领域的知名专家。

Abate与其他研究人员一道开发出了一种新型设备，可以根据液滴的荧光强度来进行分拣。这种方法与传统的微流体不同，液滴设备能通过油环境的均匀墨滴水溶液反应室包裹分子或细胞，而传统方法则是让分子和细胞裸露的通过通道。

为了解决自养无法培养的微生物问题，Abate采用了这种基于细胞遗传特性的方法来分拣，研究人员将这个过程称为“基因组流式细胞术”。

Abate解释道，微生物学家常常希望能够根据特殊的技能群区分细胞，比如能代谢高氯酸盐的细胞，后者是一种环境污染物。但要找出这些细胞来并不容易，“用传统的流式细胞仪，几乎不可能根据细胞核酸组成来进行分类，”他说，反而是PCR，“能进行细节扩增，你要做的就是改变引物和探针，从而能找到靶标细胞。”

由此Abate提出了PCR激活细胞分拣方法：PACS（PCR-activated cell sorting）。每个液滴都包含有一个单细胞，PCR试剂，靶向靶标序列的引物，以及一个荧光TaqMan探针。成功扩增细胞中的DNA，就能得到一个荧光信号，然后通过激光微流控电路进行检测，由此来分拣。

近期Abate也发表了这样的一篇论文，对大肠杆菌进行了分拣，这些细菌有的能合成TolA蛋白，有的不能。(PLOS ONE，10:e0113549，2015年)

PCR+FACS系统如何尝试：

Abate说，研究人员可以重复他的芯片设计，但他们还需要显微镜、软件、激光器和电子运转器，这一套算下来大约为4万美元（当地价格）。比较简单的方法就是构建PCR液滴乳液，在FACS中进行分拣（Lab Chip，13:4563-72，2013年)。

“目前市场上有droplet generators，”Abate说，但还是需要获得乳液，如Dolomite Microfluidics。“FACS无法在油环境下工作，它需要油滴包裹水滴，悬浮在水中，对于流式细胞仪来说，这就像一个细胞。”

（生物通：张迪）

原文摘要：

PCR-Activated Cell Sorting for Cultivation-Free Enrichment and Sequencing of Rare Microbes

Microbial systems often exhibit staggering diversity, making the study of rare, interesting species challenging. For example, metagenomic analyses of mixed-cell populations are often dominated by the sequences of the most abundant organisms, while those of rare microbes are detected only at low levels, if at all. To overcome this, selective cultivation or fluorescence-activated cell sorting (FACS) can be used to enrich for the target species prior to sequence analysis; however, since most microbes cannot be grown in the lab, cultivation strategies often fail, while cell sorting requires techniques to uniquely label the cell type of interest, which is often not possible with uncultivable microbes. Here, we introduce a culture-independent strategy for sorting microbial cells based on genomic content, which we term PCR-activated cell sorting (PACS). This technology, which utilizes the power of droplet-based microfluidics, is similar to FACS in that it uses a fluorescent signal to uniquely identify and sort target species. However, PACS differs importantly from FACS in that the signal is generated by performing PCR assays on the cells in microfluidic droplets, allowing target cells to be identified with high specificity with suitable design of PCR primers and TaqMan probes. The PACS assay is general, requires minimal optimization and, unlike antibody methods, can be developed without access to microbial antigens. Compared to non-specific methods in which cells are sorted based on size, granularity, or the ability to take up dye, PACS enables genetic sequence-specific sorting and recovery of the cell genomes. In addition to sorting microbes, PACS can be applied to eukaryotic cells, viruses, and naked nucleic acids.