中科院Cell Res发表CRISPR研究新成果

来自中国科学院上海生命科学研究院、上海科技大学等处的研究人员报告称，他们利用CRISPR/Cas9系统开发出了一种由内含子靶向介导、可维持内源基因完整性的基因敲入（knockin）方法。这一重要的研究成果发表在4月7日的《细胞研究》(Cell Research)杂志上。

　　

生物通报道  来自中国科学院上海生命科学研究院、上海科技大学等处的研究人员报告称，他们利用CRISPR/Cas9系统开发出了一种由内含子靶向介导、可维持内源基因完整性的基因敲入（knockin）方法（延伸阅读：Nature子刊：用CRISPR操控表观基因组 ）。这一重要的研究成果发表在4月7日的《细胞研究》(Cell Research)杂志上。

中国科学院上海生命科学研究院神经科学研究所的杜久林（Jiu-lin Du）研究员是这篇论文的通讯作者。其主要研究方向是感觉整合与学习记忆行为产生的分子、突触和神经回路机制，以及血管发育和功能的神经调节。

将外源基因整合进特异性基因组位点中，这类遗传工程动物成为了当前生物学研究的一种多功能工具。斑马鱼作为一种新兴的脊椎动物模型，被广泛地应用于遗传、发育生物学和神经生物学研究中。尽管近年来适用于斑马鱼的功能丧失性基因组编辑技术得到很好地开发，尚缺乏可行的方法将大片段的外源DNA序列插入到斑马鱼基因组中，成为了斑马鱼相关研究的一个瓶颈。

有研究报道称，通过TALEN介导的双链断裂和同源重组（HR）以较低的效率，将增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的编码序列整合到了斑马鱼的酪氨酸羟化酶(th)基因座中。然而，由于靶基因遭到破坏，EGFP未能获得表达。近期，有人利用II型细菌CRISPR/Cas9开发出了两种基于非HR的基因敲入方法，以相对较高的效率将反式激活因子Gal4和EGFP插入到了斑马鱼基因组位点中。然而，由于插入往往发生在靶基因的外显子或顺式调控元件内，导致内源靶基因编码序列遭到破坏，或是插入的外源基因表达模式无法很好地重演内源基因模式。这些缺点限制了它们在神经科学研究中的应用。

在这篇新文章中研究人员报告称，他们利用HR来设计供体，利用非HR实现供体整合，开发出了一种新型的CRISPR/Cas9介导的内含子靶向基因敲入策略，可在不破坏内源靶基因的情况下有效构建出基因敲入斑马鱼。作者们指出，相比于HR，利用非同源性末端接合(Non-homologous end joining, NHEJ)在斑马鱼中实现非HR基因敲入有两个优势。第一，在斑马鱼早期发育过程中NHEJ比HR的活性至少高10倍。第二，不同于HR, NHEJ不需要亲本斑马鱼基因组序列与靶向供体之间具有精确的同源性，避免了对亲本斑马鱼耗时的筛选和基因分型。

更为重要的是，为了维持内源靶基因的完整性，研究人员设计出了一些sgRNAs靶向内含子，因此NHEJ介导的插入/缺失突变不会改变靶基因的阅读框。并且相比于基于外显子的靶向策略，内含子靶向策略理论上还可将框内插入速率提高3倍。此外，他们还人为地将从sgRNA靶位点到3′基因间隔区的内源基因组序列添加到了供体质粒中。作者们说这样做有两个好处：第一是插入的外源基因可以真实地重演内源靶基因的表达模式，第二维持了内源靶基因的表达和功能。

高效、迅捷且能够维持靶基因的完整性，新策略具有的这些优势特征使得它成为了一种适用于斑马鱼甚至其他生物体的基因敲入方法。

（生物通：何嫱）

生物通推荐原文摘要：

Intron targeting-mediated and endogenous gene integrity-maintaining knockin in zebrafish using the CRISPR/Cas9 system

Animals carrying exogenous genes integrated at specific genomic loci are versatile tools for biological research1. Zebrafish (Danio rerio), an emerging vertebrate animal model, is widely used in studies on genetics, developmental biology and neurobiology. Although loss-of-function genomic editing for zebrafish has been well developed2,3,4, lack of feasible methods for inserting a large exogenous DNA sequence into the zebrafish genome is becoming a bottleneck for zebrafish-relevant research……

作者简介：

杜久林

1988.09-1993.07 中国科学技术大学 生物物理专业 理学学士 1993.09-1998.12 中国科学院上海生理研究所 神经生物学 理学博士 1998.12-2000.06 中国科学院上海生理研究所 视觉生理学 助理研究员 2000.07-2001.06 日本东京大学 视觉神经生物学 访问学者 2001.07-2001.11 复旦大学 视觉神经生物学 讲师 2001.12-2002.06 复旦大学 视觉神经生物学 副教授 2002.07-2005.12 美国加利弗尼亚大学伯克利分校 神经生物学 博士后 2005.12-至今 中国科学院上海生命科学研究院神经科学研究所 神经生物学 研究员

研究方向及内容：
本研究组以斑马鱼为模式动物，结合分子生物学、活体电生理记录、活体双光子显微镜成像和行为学分析等方法，研究：1. 感觉整合与学习记忆行为产生的分子、突触和神经回路机制；2. 血管发育和功能的神经调节。