专家指导癌症干细胞研究（实验方法）

　　

生物通报道：最早研究人员是在1997年发现了急性髓系白血病（AML）血液样品中的癌症干细胞，但是由于采用表面标记物证明实体肿瘤中癌症干细胞的存在，常常会出现不一致的结果，因此这一理论也引发了激烈的讨论。但是近年来科学家们在所有癌症类型（胶质母细胞瘤、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌和肺癌）中发现了具有自我更新能力，启动肿瘤发生的细胞，因此讨论不再围绕着“癌症干细胞是否存在？”了，而是变成了“癌症干细胞的类型有多少种？”

要想了解癌症干细胞并不容易，其中一大阻碍就是癌症干细胞的获得，许多医院会对肿瘤样品进行冷冻切片，而要从解冻组织中获得可用的细胞就没有从新鲜样品中取样那么简单了。另外一个问题在于根据细胞表面标记分离高纯度的细胞群。近期The Scientist杂志找到了一些专家，请教了他们在这些方面的经验。

小鼠体内实验

通过流式细胞仪分离细胞的“金标准”对于癌症干细胞研究来说并不完整，后者还需要将干细胞移植到免疫功能低的小鼠体内，检验这些细胞是否能发展成一个完整肿瘤。这一过程通常包括稀释细胞，按不同稀释量注射到小鼠体内，如果一个肿瘤中的细胞数量与其最初注射的细胞数量成正比，那么就能肯定实验获得的细胞就是癌症干细胞了。

对于血液癌症，比如AML来说，细胞可以通过尾静脉注射进行移植，AMLs通常在两个星期后就会生长出来。

而对于实体肿瘤来说，细胞常常是移植到肿瘤形成的器官附近，稀释后的细胞组分会与基底膜（一种用于支持细胞生长的凝胶状蛋白）混合，像是结肠癌肿瘤，在注射后平均100天内就能形成肿瘤，但是在8个星期至6个月的时间里小鼠任何地方也都有可能长出肿瘤来。

来自斯坦福大学的Michael Clarke认为乳腺癌的操作方法又不同，可根据小鼠性别和细胞输入方法而发生变化，他建议乳腺癌干细胞应该与雌激素药物一同注射到雌性小鼠的乳腺脂肪垫上（由于雌激素常参与乳腺癌的发展），而三阴性乳腺癌则需要2-6个月的时间才能生长出来，ER+肿瘤需要一年时间。

对于移植实验来说需要注意的一点就是，并不是所有分离出来的癌症干细胞都能移植生长出来，其中的原因目前还不清楚，但这可能是癌细胞生长还需要其它的免疫细胞类型，尤其是实体肿瘤。

从病患体内活动细胞，到将其注射到小鼠体内这一段时间也很重要，“越快将这些细胞移植入小鼠中，移植成功的可能性越大，”Clarke说。来自多伦多的John Dick研究组则通过加紧与临床医师们的联系，能在短短两个小时时间内就能将AML病患样品移植到小鼠体内。

体外实验

体外检测也有助于确定癌症干细胞，而且也能进行相关的癌症生物学研究。由于癌症干细胞似乎是在三维基底膜的环境下生长的更好，因此研究人员常常采用立体形成分析方法来检验这些细胞的自我更新能力。

一种体外方法就是组织化培养体系（organoid culture system，生物通译），也就是说包含生长因子的一种三维培养基，帮助细胞形成微器官。Clevers 实验室在2009年开发出了一个这样的体系，能生长出内小肠和结肠的结构，被称为肠腺(intestinal crypts)，之后研究人员还将这一技术扩展到癌细胞中（Gastroenterology, 141:1762-72, 2011）。

这些体外实验不能替代体内移植验证实验，在小鼠体内无法形成肿瘤的癌症干细胞在培养基中也能生长，反之亦然，因此两项实验都要进行。

另外需要注意的是像是AML这样的血液癌症培养条件目前还未建立，与实体肿瘤不同，这种癌症并不需要表面附着生长，为了解决这个问题，研究人员一般都是通过小鼠进行体内实验。

最后一旦能确定这些分离出来的是癌症干细胞了，就可以在小鼠或者组织化培养基中进行扩增了。这些癌症干细胞也能用于药物筛选，以及其它体内体外实验。当然需要尽可能的保证纯合的细胞群，尤其是在测序和基因表达谱分析实验中。“我们保存的癌症干细胞是否就是一个纯的细胞群，目前还没有答案，”Weissman说。

（生物通：张迪）