专家经验谈：如何进行DNA甲基化分析

生物通报道： 表观遗传学修饰是一种不改变DNA序列的重要调控机制，包括组蛋白和DNA修饰。近年来，表观基因组已经成为了生物医学领域中的一大热点。分析表观基因组图谱，研究者们可以鉴定潜在的功能性序列，注释“垃圾”基因组区域的功能。另外，DNA甲基化异常与癌症和其他发育疾病密切相关。

胞嘧啶残基的甲基化（5mC）是哺乳动物基因组中最常见的一种表观遗传学修饰，主要位于CpG岛。这种甲基化修饰在细胞生长、细胞分化、细胞增殖和疾病状态中起到了关键性的作用。启动子和其他调控区域的DNA甲基化与基因沉默有关，而基因体的高度甲基化往往是活跃转录的标志。

重亚硫酸盐测序本质上就是重亚硫酸盐转化与二代测序（NGS）的结合。这一技术是在全基因组范围内分析DNA甲基化的基础工具，也是是甲基化研究中最受欢迎的技术，哈佛医学院的张毅（Yi Zhang）教授说。

甲基化分析

之前有研究比较了现有甲基化分析技术的29种组合，涵盖了片段化、文库制备、处理、扩增和分析。“基本上每一种组合都是可行的，”Oklahoma大学的Willard Freeman说。

举例来说，可以在测序之前免疫沉淀甲基化片段，或者用甲基化敏感（或不敏感）的限制性酶切割DNA。如果不进行重亚硫酸盐转化，这些技术只能用来检测存在甲基化的DNA区域，不能给出确切的甲基化位点，Zymo Research公司的表观遗传学服务项目经理Keith Booher说。它们无法分辨胞嘧啶全部被甲基化的片段和胞嘧啶部分被甲基化的片段。“而重亚硫酸盐测序可以精确算出甲基化的比例。”

重亚硫酸盐处理会将所有未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不变。在测序时这些尿嘧啶被读取为胸腺嘧啶，将其与参考序列进行比较，就能确定哪些核苷酸最初是胞嘧啶。（延伸阅读：Nature Methods发表单细胞重亚硫酸盐测序技术）

重亚硫酸盐测序“完全转变了”DNA甲基化分析，“使这种不精确的模糊研究，达到了单核苷酸的分辨率，”加州大学的任兵（Bing Ren）教授说。

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随着测序成本的下降，越来越多的人在使用全基因组测序。“全基因组测序得出的结果价值高信息量大，”任兵教授说。“但它的价格仍然比较昂贵。”

 

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“整个人类基因组差不多有三十亿bp。以30x的覆盖度进行测序， 每个样本就要花费数万美金。我其实并不需要全部的序列，目前最感兴趣的是150-200Mb的基因组区域，包括每个基因启动子、每个CpG岛、岛岸（island shores）和岛架（island shelves），”Freeman说。Freeman等人开发的oligo-capture方法能将测序量减少将近97%，这种方法在原理上与外显子组测序差不多。与此类似的还有Agilent的SureSelectXT MethylSeq和罗氏的NimbleGen’s SeqCap Epi试剂盒。据介绍，NimbleGen’s SeqCap EZ试剂盒 “每个样本能够检测超过五百五十万甲基化位点，分辨率达到单核苷酸水平。”

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基因组富集途径还有许多，比如说靶向性捕获和扩增。扩增比较适合样本量小有针对性地研究，或者是对全基因组研究进行验证，Freeman指出。需要注意的是，在使用PCR及类似方法时，应该先进行重亚硫酸盐处理，然后使用针对转化后序列的扩增引物，因为扩增会摧毁碱基特异性的甲基化信息。

任兵教授还特别提到了“经济划算”的Illumina Infinium HumanMethylation450 BeadChip芯片。虽然芯片没有NGS那么强大（比如说不能检出肿瘤研究中备受关注的拷贝数变异），但“如果你的样本量很大，希望用甲基化进行筛查，我认为450K芯片是一个很好的选择。”

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也有研究者倾向于“非靶向性”策略，比如在测序前用抗体（MeDIP）或者甲基结合蛋白（MBD）来捕获富含CpG或者甲基化的位点。Booher认为RRBS测序（Reduced Representation Bisulfite Sequencing）是最好的方法，“该方法不使用抗体或者亲和性蛋白，而是用识别CG-dense模体的限制性内切酶处理样本，然后通过片段选择来富集启动子和基因体，避开‘基因沙漠’区域和重复序列，”他说。研究者可以通过限制性酶的组合，控制基因组的覆盖度。

不只是5mC

5mC会被逐步氧化成5-羟甲基胞嘧啶（5hmC）、5-甲酰基胞嘧啶（5fC）和5-羧基胞嘧啶（5caC），最后回到未甲基化的胞嘧啶。这些表观遗传学标签最近受到了广泛的关注。早些年，检测这些标签还存在一定的挑战，Freeman回忆道。不过“现在的检测方法已经相当成熟可靠，未来将会有更多人对它们展开研究。”

由于缺少台式测序仪（比如Illumina MiSeq）或者生物信息学专家，目前一般实验室大多还不能独立进行甲基化测序。好在“已经有很多公司涉足这一领域，为研究者们提供更专业的表观遗传学服务，比如Zymo Research公司、Epigentek公司和EpigenDx公司”Freeman说。“这些公司都声称能够提供完整的外包服务，你只需要送出DNA，就能够收到分析数据。”

参考文献：

[1] Rivera, CM, Ren, B, “Mapping Human Epigenomes,” Cell, 155(1):39-55, 2013. [PMID: 24074860]

[2] Laird, P, “Principles and challenges of genome-wide DNA methylation analysis,” Nat Rev Genet, 11(3):191-203, 2010. [PMID: 20125086]

（Josh P. Roberts撰写/叶予编译）