东北师范大学PLOS发表CRISPR研究新突破

　　

生物通报道  来自东北师范大学的研究人员报告称，他们利用CRISPR/Cas9技术在小鼠中实现了基因组大片段的删除和插入。这一研究成果发布在3月24日的《PLOS ONE》杂志上。

东北师范大学的郑耀武（Yaowu Zheng）教授和冯学超(Xuechao Feng)副教授是这篇论文的共同通讯作者。郑耀武教授长期从事基因表达和调节研究，曾建立了多种转基因动物和基因定位修饰动物模型,在Nature（5篇）, Science （2篇）、PNAS等权威杂志上发表多篇重要论文。冯学超副教授的主要研究方向是细胞水通道基因功能及动物转基因技术。

遗传工程小鼠是一种可用于分析基因功能的强大工具。传统的方法是通过同源重组来生成携带靶突变的小鼠。这种技术利用了培育的胚胎干细胞来获得嵌合体小鼠。过程繁琐、成本高昂且费时。近年来，锌指核酸酶(ZFN)、转录激活样效应因子核酸酶(TALENs)和CRISPR/Cas9系统被开发出来用于基因组编辑。

而CRISPR/Cas9系统是三者之中最新且最容易应用的工具。这一系统是通过细菌的II型规律成簇的间隔短回文重复(CRISPR)序列和它自身一种非常高效的Cas9核酸酶，来靶向目的基因造成特异的双链断裂(DSBs)而实现基因组编辑的。其已成功地应用于改造包括斑马鱼、小鼠、猴、大鼠等各种生物和人类细胞（延伸阅读：北京大学刘东课题组：用CRISPR技术调控基因表达）。

DNA大片段的插入、删除或替换是基因组编辑中面临的一个主要问题，通常片段越大重组的效率就越低。事实上，许多研究报道改造的片段大小都是1kb左右。而在许多情况下，例如删除基因簇、除去长链非编码RNAs(lncRNA)以及置换调控序列等都需要改变大片段的基因组序列。尽管一些不同的技术被开发出来用以解决这问题。例如，利用BAC和YAC系统来靶向相对较大的DNA片段。但其效率却远不能令人满意。

在这篇新文章中，东北师范大学的研究人员利用CRISPR/Cas9系统在小鼠实现了DNA大片段的删除和插入，包括删除大小约为65kb的整个Dip2a基因，以及插入超过5kb的β-半乳糖苷酶(lacZ)报告基因。通过PCR和测序研究人员证实大约11.8% (11/93)的胚胎干细胞克隆65kb删除结果为阳性。通过G418选择ES细胞，他们获得了高靶向效率，左右臂效率分别为46.2% (12/26)和73.1% (19/26)。存活幼崽和注射胚胎定向大片段删除效率分别为21.4%和6.0%。通过ES细胞转染和直接注射受精卵将lacZ报告基因定向插入NEO cassette的效率分别为27.1% (13/48)和11.1% (2/18)。

作者们表示，这些程序是通过直接共同注射受精卵或用细胞质粒DNA共同转染胚胎干细胞，绕过了体外转录。采用这些方法来生成小鼠模型从技术上讲非常容易、节约时间且符合成本效益，将必定会推动基因功能研究。

（生物通：何嫱）

生物通推荐原文索引：

Large Genomic Fragment Deletions and Insertions in Mouse Using CRISPR/Cas9.PLoS One. 2015 Mar 24;10(3):e0120396. doi: 10.1371/journal.pone.0120396.

作者简介：

郑耀武:1982年毕业于山西大学生物系植物生理学专业，获学士学位，后留校任教。1985年赴美国南卡罗莱纳大学从事醇脱氢酶基因表达与调节研究,1990年获美国南卡罗莱纳大学博士学位。1990－1993年在美国加州大学旧金山分校做博士后，研究乙肝病毒基因表达与调节。1993－2010在美国加州大学旧金山分校心血管研究所从事凝血酶受体基因功能研究,负责蛋白表达和转基因动物中心。2005年任东北师范大学特聘兼职教授，2010年任东师学者特聘教授，吉林省2010年度高层次创业创新人才，成立了东北师范大学转基因实验动物中心。长期从事基因表达和调节研究，曾建立了多种转基因动物和基因定位修饰动物模型,先后发表Nature 5篇, Science 2篇，并在Dev Cell，JCI, PNAS， BLOOD，JBC等杂志上发表多篇论文，被引用4800多次。

冯学超:2005年毕业于东北师范大学，获细胞生物学博士学位。毕业留校工作，现为东北师范大学生命科学学院教师，主要研究方向为细胞水通道基因功能及动物转基因技术，在水通道蛋白与软骨细胞功能、神经发育及肿瘤生长关系方面取得了系列原创性研究成果，在转基因技术方面应用基因打靶技术成功建立了氯离子敏感型绿色荧光蛋白转基因小鼠模型。在Glia、J Neurosci Res、CEPP、Chinese Sci Bull等杂志上发表论文16篇，其中SCI检索10篇，主持国家自然基金项目和东北师大校内基金各一项，作为主要参加人参加包括科技部973项目、美国CF基金会基金、国家自然基金等在内的项目共4项。