Nature Methods：利用CRISPR实现快速遗传筛查

　　

生物通报道  尽管已有传统的正向和反向遗传操作技术被用来鉴别维持生命必需的关键分子信号通路，通常评估的靶标数量有限，且非常的费时。诸如RNAi一类的反向遗传筛查技术虽然在无脊椎动物模型和细胞培养系统中显示出强大的效力，可用于快速鉴别与许多生物学过程相关的基因和信号通路，目前仍然缺乏适用于体内脊椎动物模型系统的高效、廉价的方法。

近日，来自Fred Hutchinson癌症研究所的研究人员报告称，他们发现可通过改变Cas9和sgRNA浓度的方式来提高CRISPR的效率，并证实CRISPR可以作为一种强大的反向遗传筛查策略适用于脊椎动物系统。研究结果发布在4月13日的《自然方法》（Nature methods）杂志上。

在过去的20年里，斑马鱼逐渐成为研究人类基因功能的重要脊椎动物模式生物。斑马鱼胚胎和幼鱼具有个体小，易于获取，胚胎透明的特点，可以在单细胞水平上进行大量活体检测分析，十分适用于基因功能研究。斑马鱼基因功能大部分是通过“正向遗传学”手段揭示的，首先在斑马鱼基因组中引入随机突变，在子代中鉴定表型的改变，但使用这种方法鉴定致畸突变工作量很大。

最初作为细菌和古细菌的一种适应性防御机制被发现的CRISPR，近年来作为一种强有力的基因编辑分子生物学工具，被广泛地应用于斑马鱼、人类、大鼠、小鼠、果蝇、家蚕、线虫、酵母、拟南芥、烟草、高粱、水稻和小麦等各类动植物个体或细胞基因组的遗传学改造（延伸阅读：Nature揭秘CRISPR系统的选择识别机制 ）。CRISPR能够借助同源介导修复（HDR）或非同源末端连接(NHEJ)有效靶向基因组，导入一些改变来扰乱基因功能，由此认识感兴趣的基因对于生物过程所造成的影响。

只需要长度约为100个核苷酸一段向导RNA分子（sgRNA） ，以及一个能够切割DNA分子的Cas9核酸酶，II型CRISPR系统作为一种反向遗传工具尤其具有吸引力。在斑马鱼的单细胞期，将Cas9编码mRNA和sgRNA导入到胚胎中就可以诱导出可通过种系传递的突变。

在这篇Nature methods新文章中，研究人员称成功利用工程CRISPR有效地突变了斑马鱼中一些特定的位点，并筛查出了与一些脊椎动物生物过程相关的基因。他们证实通过注射优化数量的Cas9编码mRNA和多重sgRNAs可提高CRISPR的效率，使得能够在胚胎中模拟一些已知突变的表型。借助于48种sgRNA靶向与突触发生相关的潜在基因，他们鉴别出了两个与电突触形成相关的新基因。通过深度测序靶位点，研究人员证实90%的基因得到有效地筛查。

由此，研究人员提出CRISPR可作为一种强大的体内反向遗传筛查策略应用于脊椎动物系统。

（生物通：何嫱）

生物通推荐原文摘要：

Rapid reverse genetic screening using CRISPR in zebrafish

Identifying genes involved in biological processes is critical for understanding the molecular building blocks of life. We used engineered CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats) to efficiently mutate specific loci in zebrafish (Danio rerio) and screen for genes involved in vertebrate biological processes. We found that increasing CRISPR efficiency by injecting optimized amounts of Cas9-encoding mRNA and multiplexing single guide RNAs (sgRNAs) allowed for phenocopy of known mutants across many phenotypes in embryos. We performed a proof-of-concept screen in which we used intersecting, multiplexed pool injections to examine 48 loci and identified two new genes involved in electrical-synapse formation. By deep sequencing target loci, we found that 90% of the genes were effectively screened. We conclude that CRISPR can be used as a powerful reverse genetic screening strategy in vivo in a vertebrate system.