确定新致癌基因的高效CRISPR/Cas9平台

最近，来自澳大利亚墨尔本大学的研究人员改进了现有的CRISPR/cas9技术，使该系统更有效，适用于更广泛的细胞类型，以及是时间可控的。他们设计了一种慢病毒载体平台，允许细胞的有效转染，随后用Cas的伴随组成型表达，诱导sgRNA的表达。

　　

生物通报道：操纵感兴趣的基因，对于解密细胞或整个生物体内许多信号转换器、基因表达调节器和结构部件的作用，一直都是及其重要的。几十年来，在细胞系或原代细胞中的基因异位表达一直都是容易实现的，但是基因消融（及其产品）已经成为一个相当困难的任务，特别是在小鼠之外的物种。抑制基因表达的最初尝试包括RNA反义技术，但是没有研究证明它是非常强大的和有效的。RNAi的发现改进了基因打靶方法，使其在首次能够体外及体内敲除几个物种细胞内的基因表达。

然而，某些基因产物的水平只能降低到一个较小的程度或根本没有；特别是在细胞持续生长必不可少的基因的情况中。大量新的基因组编辑技术，如锌指核酸酶（ZFNs）或转录激活因子样核酸酶（TALENs），为克服这些障碍铺平了道路。有了这些技术，就可能产生靶向基因突变，通过直接突变基因组，而不是通过降解mRNA产物，在不同物种细胞系乃至全部生物体中实现基因敲除。虽然更可靠，但是产生ZNFs和TALENs的复杂性使得这种方法的常规使用极具挑战性。最近开发的CRISPR / cas9基因组编辑技术以其高效、方便、快速和较低的花费，似乎已经取代ZNFs和TALENs成为许多实验室的首选方法。延伸阅读：基于CRISPR的诱导性体内基因组编辑。

聚集的、定期间隔的短回文重复CRISPRs/cas9系统，利用化脓性链球菌cas9核酸内切酶的DNA裂解能力，可通过一段工程小导向RNA（sgRNA），被引向基因组中特定的DNA序列中。DNA裂解的合成部位，通过非同源末端连接（NHEJ）修复。这种DNA修复机制以高频率把随机突变引入靶基因，导致其功能失活。Cas9核酸内切酶需要sgRNA介导的构象激活来促进DNA的结合和裂解。

尽管CRISPR / cas9介导的基因失活可提供一些优势，但仍有几个技术问题阻碍了其在许多实验设置中的使用。当前cas9介导的基因编辑工具，仍需要后续的表型或基因筛选，通常需要选择比较罕见的修饰细胞。这使得我们无法靶定可能使细胞失活的必需基因。此外，利用现有的CRISPR / cas9方法，在大部分细胞中的NHEJ修复总效率太低，因此不能评估基因失活的功能性影响。

为了克服这些问题，来自澳大利亚墨尔本大学的研究人员，试图改进现有的CRISPR / cas9技术，使该系统更有效，适用于更广泛的细胞类型，以及是时间可控的。为此，该研究小组设计了一种慢病毒载体平台，允许细胞的有效转染，随后用Cas的伴随组成型表达，诱导sgRNA的表达。研究人员在人类和小鼠细胞系中，通过体外敲除促凋亡BH3-only蛋白BIM，验证了这一新平台的效率。为了证明该系统能够有效靶定细胞持续生长所必需的基因，研究人员有条件地删除了人类伯基特淋巴瘤（BL）细胞中的Mcl-1，这些细胞的生存高度依赖于这种抗凋亡Bcl-2家族成员。相关研究结果发表在三月三日的《Cell Reports》杂志。

一旦诱导Mcl-1 sgRNA，这些细胞就以非常高的频率死亡，这与由NHEJ机制引入Mcl-1基因的InDels个数（插入的DNA碱基缺失）相关。有趣的是，当采用新开发的新一代测序技术时，研究人员发现，单个sgRNAs诱导的Indels的频率和性质彼此高度相似，这表明CRISPR / cas9诱导的NHEJ过程，并不像最初设想的那样随机。

最后，该研究小组用这一系统，通过将基本Cas9和诱导型Trp53 sgRNAs导入造血干/祖细胞（HSPC），然后移植到骨髓消融受体小鼠，制备了造血细胞受限的TRP53基因敲除小鼠。有趣的是，该研究小组不仅产生了导致TRP53蛋白损失的突变，也产生了促进淋巴瘤发展的新突变TRP53蛋白。从而表明，这种高效诱导性CRISPR / cas9平台可以用来确定驱动肿瘤发生的新基因突变。

（生物通：王英）

生物通推荐原文摘要：
An Inducible Lentiviral Guide RNA Platform Enables the Identification of Tumor-Essential Genes and Tumor-Promoting Mutations In Vivo
Summary: The CRISPR/Cas9 technology enables the introduction of genomic alterations into almost any organism; however, systems for efficient and inducible gene modification have been lacking, especially for deletion of essential genes. Here, we describe a drug-inducible small guide RNA (sgRNA) vector system allowing for ubiquitous and efficient gene deletion in murine and human cells. This system mediates the efficient, temporally controlled deletion of MCL-1, both in vitro and in vivo, in human Burkitt lymphoma cell lines that require this anti-apoptotic BCL-2 protein for sustained survival and growth. Unexpectedly, repeated induction of the same sgRNA generated similar inactivating mutations in the human Mcl-1 gene due to low mutation variability exerted by the accompanying non-homologous end-joining (NHEJ) process. Finally, we were able to generate hematopoietic cell compartment-restricted Trp53-knockout mice, leading to the identification of cancer-promoting mutants of this critical tumor suppressor.