北京大学刘东课题组：用CRISPR技术调控基因表达

　　

生物通报道  来自北京大学生命科学学院的研究人员报告称，他们利用构建的dCas9融合系统在线虫和斑马鱼中调控了基因的表达。研究成果发布在3月27日的《细胞研究》（Cell Research）杂志上。

北京大学生命科学学院刘东（Dong Liu）研究员和博士研究生刘朋朋( Pengpeng Liu)是这篇论文的共同通讯作者。刘东研究员的主要科研领域包括感觉神经器官的发育，以及听觉形成与再生（延伸阅读：北京大学Cell Res发表CRISPR研究新成果）。

CRISPR/ Cas系统是目前发现存在于大多数细菌与所有古细菌中的一种后天免疫系统，它能够整合来自外源入侵者的少量基因，像疫苗一样发挥作用。细菌可以参考这一信息库来识别和攻击入侵者。

目前已发现三种不同类型的CRISPR/ Cas系统，其中II型CRISPR/ Cas系统组成较为简单，以Cas9蛋白以及向导RNA(gRNA)为核心组成。经由遗传工程改造，II型CRISPR/ Cas系统已成为一种适用于在培养细胞和整个生物体中实现定向诱变的基因组编辑工具。

近来有研究人员报告称，他们基于传统CRISPR/Cas9基因编辑系统构建出了一些新型的基因调控工具：可用于下调基因的CRISPR干扰（CRISPRi）和上调基因的CRISPR激活（CRISPR-on）技术。

CRISPRi是指利用缺失核酸内切酶活性的Cas9（dCas9）与单条导向RNA共表达,来产生一种DNA识别复合物, 利用这种复合物特异性干扰转录延伸,RNA聚合酶结合,或转录因子结合。该技术可以通过两条sgRNA的导入实现很强的基因沉默效果。不同于传统的RNA干扰技术，CRISPRi能够同时沉默任意数量的单个基因。并且，关闭非靶向基因的风险很小。此外，与RNA干扰阻止蛋白质生成不同，CRISPRi是通过阻止DNA信息被读写为RNA来发挥作用。CRISPR-on则是给缺失核酸内切酶活性的Cas9添加一个转录激活结构域。生成的酶无需永久改变DNA就可以提高基因的表达。

在这篇文章中，研究人员证实将Krüppel associated box (KRAB)结构域与dCas9融合，可以更有效地抑制靶基因。而融合转录激活子VP16的CRISPR-on技术则可通过3-4条（可多达7条）基因特异性的gRNAs识别靶基因的近端启动子在培养细胞和体内中提高基因的表达。研究人员在线虫和斑马鱼中应用了这些CRISPRi和CRISPR-on工具，证实他们的dCas9融合系统可通过靶向特异性的gRNAs (ts-gRNAs)在内源表达位点上或附近改变基因表达。

北京大学的研究人员在新研究中证实了他们开发的dCas9融合系统是在整个生物体中调节内源基因表达的一种理想的技术。理论上，ts-gRNA引导dCas9融合蛋白可用于靶向和干扰增强子、沉默子、基因绝缘子、内含子等等非编码元件，借助覆盖全基因组的ts-gRNAs，可以在线虫和斑马鱼两种动物中很容易地完成高通量分析解读基因功能和遗传网络。

（生物通：何嫱）

生物通推荐原文摘要：

Regulation of transcriptionally active genes via the catalytically inactive Cas9 in C. elegans and D. rerio

CRISPR interference (CRISPRi) is a recently developed tool used to study single guide RNA (gRNA)-mediated sequence-specific repression of transcription in both prokaryotic and eukaryotic cells1,2,3,4,5. Transcription initiation and elongation of a gene can be interfered by the presence of gRNA:DNA hetero-duplex/dCas9 (a catalytically inactive form of Cas9) complex in its promoter and exons. If Krüppel associated box (KRAB) domain is fused to dCas9, repression of target gene is more efficient. Likewise, fusion of a transcription activator such as VP16 (CRISPR-on) can increase target gene expression through three to four gene-specific gRNAs (up to seven) that recognize the proximal promoter of a target gene in cultured cells and in vivo2. We applied both CRISPRi and CRISPR-on tools in worm and zebrafish, and demonstrated here that our dCas9 fusion systems modify gene expression at or near their endogenous expression location(s) through target-specific gRNAs (ts-gRNAs).