广州生物院JBC发表干细胞新成果

三月二十日，来自中科院广州生物医药与健康研究院等处的研究人员，在国际著名学术期刊《Journal of Biological Chemistry》发表学术论文，该研究检测了iPSC生成及随后基因校正过程中的基因组不稳定性，指出重编程和基因打靶可能会产生大量但却不同的基因组变化，因此，在iPSC诱导时及基因打靶之后，必须进行严格的基因组监控和选择。

　　

生物通报道：三月二十日，来自中科院广州生物医药与健康研究院、武汉菲沙基因信息有限公司（Frasergen）和加拿大西蒙佛雷泽大学的研究人员，在国际著名学术期刊《Journal of Biological Chemistry》发表学术论文，该研究检测了iPSC生成及随后基因校正过程中的基因组不稳定性，指出重编程和基因打靶可能会产生大量但却不同的基因组变化，因此，在iPSC诱导时及基因打靶之后，必须进行严格的基因组监控和选择。延伸阅读：更安全的干细胞培养新方法。

本文通讯作者是中科院生物医药与健康研究院研究员潘光锦博士，其2002年硕士毕业于山东医学科学院，2005年博士毕业于清华大学医学院，随后在美国威斯康星大学-麦迪逊从事博士后研究，2010年至今为中科院广州生物医药与健康研究院研究员。主要从事人胚胎干（ES）细胞多能性及自我更新的分子生物学调控和人诱导性多能干（iPS）细胞的形成及临床应用的可行性实验室研究，研究成果曾经发表在Cell、Cell Stem Cell、FASEB J、JBC等国际学术期刊。

人体诱导多能干细胞（iPSCs），可以进行无限的自我更新，同时又保持产生体内所有类型体细胞的潜力，从而为发育生物学研究、疾病模型，以及在再生医学上的应用开辟了新的途径。将iPSCs生成与靶向基因组编辑相结合，的确已被用于构建各种遗传疾病的模型，包括β-Thal。

β-Thal是世界上最常见的一种遗传性疾病，患者患有严重贫血，需要定期输血。这种疾病是由β血红蛋白基因（HBB）突变或缺失引起的，可破坏正常红血细胞的功能。目前，从健康供体移植骨髓，是治愈β-Thal的唯一方法，但这种治疗受到人类白细胞抗原（HLA）匹配供体缺乏的限制。

从理论上讲，在突变HBB靶向基因组校正后从β-Thal患者生成iPSCs，可能是这些疾病一种理想的新疗法。最近开发的基因组编辑工具，如锌指核酸酶（ZFNs）、转录激活因子样核酸酶（TALENs）和聚集调节间隔短回文重复（CRISPR）/Cas9为基础的RNA引导DNA内切酶，大大提高了人类iPSCs或ESCs的基因打靶效率，从而能够生成个性化的、基因校正的iPSCs用于细胞治疗。然而，重编程和随后的基因打靶步骤，是否会生成有害的的基因组变化，在这种类型用细胞治疗用于临床实践之前还需要进行评估。

产生基因校正的iPSCs ，需要因子诱导的体细胞重编程和核酸酶辅助的基因打靶步骤。重编程或基因打靶技术对基因组稳定性的影响，已经吸引了诸多关注。例如，据报道，iPSCs比其他细胞系（比如ES细胞或体细胞）携带更频繁的CNVs。这些CNVs中的一些确实归因于细胞重组过程。然而，另一项研究报道了极少数的核苷酸水平变化，如非同义SNVs和INDELS，在通过非病毒方法产生的iPS细胞中被发现。同样，基因组编辑工具（如TALENs或CRISPR/cas9）对基因组稳定性的影响也被分析过。一般来说，基于全基因组测序数据，这些基因组编辑工具似乎没有引起太多的基因组变化，表明这些工具应用于临床可能是安全的。

这项研究的目的是，通过基因校正的β-Thal iPSCs产生过程，检测所产生的基因组变化，包括通过非病毒方法、克隆选择、扩增、基因组编辑和外源基因切除的iPSC生成。首先，研究人员用携带HBB第二内含子（位点654）纯合点突变的羊水细胞，生成了一个非整合型的β-Thal iPSC细胞系。

然后，研究人员通过ZFN辅助的基因打靶和外源耐药基因切除，校正了两个突变的HBB等位基因，以获得最终的HBB校正iPSCs。接下来，研究人员对亲代细胞进行了连续的CGHs和外显子组测序。

这些研究结果表明，即使用非病毒方法，iPSC诱导也可能会产生一定数量的变化，包括CNVs和SNVs。同时，随后的ZFN辅助基因打靶会造成可以忽略的CNVs，但是更多的SNVs。分析结果表明，因素诱导的体细胞重编程和ZFN辅助的基因打靶，往往会产生不同的基因组变化。在个性化基因校正iPSC细胞治疗应用于临床之前，需要对这些变化进行仔细的分析和评估。

（生物通：王英）

生物通推荐原文摘要：
Factor Induced Reprogramming and Zinc Finger Nuclease Aided Gene Targeting Cause Different Genome Instability in β-thalassemia iPSCs
Abstract: Generation of personalized iPSCs followed by targeted genome editing provides an opportunity for developing customized effective cellular therapies for genetic disorders. However, whether edited iPSCs harbor unfavorable genomic variations needs to be critically ascertained before their clinical application. To examine the mutation status of the edited iPSC genome and trace the origin of possible mutations at different steps, we have generated virus-free iPSCs from amniotic cells carrying homozygous point mutations in β-hemoglobin gene (HBB) that cause severe β-thalassemia (Thal), corrected the mutations in both HBB alleles by ZFN-aided gene targeting, and obtained the final HBB gene corrected iPSCs by excising the exogenous drug resistant gene with Cre recombinase. Through comparative genomic hybridization (CGH) and whole-exome sequencing, we uncovered 7 copy number variations (CNVs), 5 small insertions/deletions (Indels) and 64 single nucleotide variations (SNVs) in β-Thal iPSCs before the gene targeting step, and found a single small CNV and 19 Indels and 340 SNVs in the final gene-corrected β-Thal iPSCs. Our data revealed substantial but different genomic variations occurred at factor induced somatic cell reprogramming and ZFN aided gene targeting step, suggesting that stringent genomic monitoring and selection is needed both at the time of iPSC derivation and after gene targeting.