单细胞表观遗传学研究指南（下）

生物通报道 ：随着测序成本的直线下降，解读一个生物的基因组正在逐渐成为研究者们的日常工作。然而，并不是所有细胞都能够达到测序要求，测序一般需要几千到一百万细胞。举例来说，如果你研究的是早期胚胎发育，那么可用的细胞数量就很少，在这种情况下每一个细胞都很宝贵。

The Scientist最近撰文详细介绍了单细胞表观遗传学研究中的一些关键技术。这些技术可以帮助我们在单个细胞中检测DNA、组蛋白和染色质水平上的表观遗传学修饰。

染色质水平的改变

高等生物的细胞核负责储存基因组DNA，这些DNA环绕着由四种组蛋白组成的八聚体，形成碟状的核小体结构。基因组DNA以这样的形式包装成为染色质，使DNA受到良好的保护。

所有控制基因转录的调控蛋白，都要结合在DNA上起作用。而染色质的3D结构会随着细胞生活周期而变化，调节调控因子所能接触到的基因。

人们一般使用染色质构象捕获技术，在细胞群体中研究染色质水平上的改变。但这种技术只能给出平均的3D结构，“你无法了解单细胞的染色质结构，”剑桥大学的Ernest Laue教授说。Laue教授之前参与的一项研究就解决了这个问题，找到了在单细胞中对染色质弯曲和折叠进行定量的方法。这个方法主要是Babraham 研究所的Takashi Nagano开发的，他成功将传统Hi-C的基础步骤应用到了单细胞中。研究人员在单个细胞的细胞核中交联染色质以保持环的形态，用酶消化掉非交联的染色质，然后连接自由末端并进行测序，在。（延伸阅读：Nature揭示染色体真实面貌）

进行这样的微量操作，需要我们在细节处理上一丝不苟。据Laue介绍，目前只有Nagano总能获得一致性的实验结果。此外，测序后的计算分析也是这个方法的关键所在，因为DNA扩增会带来许多噪音信号。

揭露组蛋白上的修饰

细胞中的表观遗传学改变也发生在组蛋白水平上，比如甲基化、乙酰化和磷酸化。现在人们已经找到了在单细胞中成像组蛋白修饰的方法。美国弗吉尼亚大学的Delphine Gomez和Gary Owens合作，通过荧光探针和原位杂交分析了平滑肌细胞里的组蛋白修饰。他们对邻位连接检测进行了改良，利用二抗点亮存在表观遗传学修饰的组蛋白。虽然这一方法只能用于固定了的组织，但在不同发育阶段对细胞进行检测，可以揭示随着时间推移而发生的改变。（原文连接：Nat Methods, 10:171-77, 2013,）

如果你需要检测活组织中的组蛋白表观遗传学修饰，你可以参考Kazuki Sasaki等人开发的检测技术。这个RIKEN团队在荧光共振能量转移FRET的基础上构建了新型感应器，以监控特定组蛋白残基上的乙酰化。他们开发的探针称为Histac，主要适用两种荧光蛋白夹着一个组蛋白和一个能识别组蛋白乙酰化的溴区结构域(Bromodomain)。当乙酰化不存在时，Histac感应器会生成很强的荧光信号。当组蛋白被乙酰化的时候，构象改变会拉开两个FRET元件的距离，生成较弱的荧光信号。研究人员用这个技术观察了有丝分裂过程中的组蛋白乙酰化改变。（原文连接：PNAS, 106:16257-62, 2009）不过Sasaki等人提醒道，目前这种探针需要向细胞中引入外源组蛋白，有改变细胞基因表达的可能。未来的新一代的Histac探针将会避免这一问题。（原文连接：Bioorg Med Chem, 20:1887-92, 2012）

前景展望

对于前文提到的单细胞表观遗学研究方法而言，污染问题都是重中之重，因为这类实验的样本和试剂量都很小。如果你的DNA样本很多，那么扩增步骤通常能盖过污染。但对于单细胞研究来说，“整个流程的每一步都有可能引入污染，破坏掉真实的信息，”Kelsey说。“我们可以参照二三十年前做PCR时的那些注意事项。”

研究者们普遍认为，单细胞表观遗传学领域的下一步发展，是将多种研究方法的结合起来使用。在未来几个月或者几年里，我们将会看到能在单个细胞中同时检测转录组和表观基因组的技术。深入了解更多的单细胞信息，可以帮助人们理解不同细胞之间的差异，以及这些差异对发育或疾病状态所产生的影响。

上接：单细胞表观遗传学研究指南（上）

 

生物通编辑：叶予

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