单细胞表观遗传学研究指南（上）

生物通报道：随着测序成本的直线下降，解读一个生物的基因组正在逐渐成为研究者们的日常工作。然而，并不是所有细胞都能够达到测序要求，测序一般需要几千到一百万细胞。举例来说，如果你研究的是早期胚胎发育，那么可用的细胞数量就很少。

在这种情况下每一个细胞都很宝贵，新加坡A*STAR分子与细胞生物学研究院的Daniel Messerschmidt说。为了研究早期胚胎中的表观遗传学修饰，Messerschmidt及其同事开发了一个能够在单细胞中分析DNA甲基化的新技术。这项发表在Science杂志上的成果，使Messerschmidt成为了单细胞表观遗传学领域的先行者。（原文：Single-cell DNA-methylation analysis reveals epigenetic chimerism in preimplantation embryos）

除了研究稀少细胞中的基因表达，单细胞表观遗传学检测技术还有着很大的应用空间，比如说可以用来研究细胞异质性很大的肿瘤。发育早期的表观遗传学错误能够影响终生，很可能引发疾病。另外，健康组织中也存在着表观遗传学多样性。“以往的生物学教条是，我们从父母继承到的基因组在所有细胞里是始终如一的，”单细胞基因组学专家，Leuven大学副教授Thierry Voet说，但现在这一观点已经被颠覆。

The Scientist最近撰文详细介绍了单细胞表观遗传学研究中的一些关键技术。这些技术可以帮助我们在单个细胞中检测DNA、组蛋白和染色质水平上的表观遗传学修饰。

分离单细胞

在进行单细胞表观遗传学分析之前，你需要先确定自己拿到了正确的细胞或细胞类型。

如果你想要的细胞已经处于悬浮状态（比如循环肿瘤细胞），而且含量相对比较丰富，那么流式细胞分析将是你的理想选择。如果你的样本是实体组织，那么可以用酶分解掉胶原和其他细胞外蛋白。不过酶学消化对细胞影响较大，甚至可能改变基因转录情况，Voet提醒道。在把组织细胞制成悬液之后，我们就可以通过特异性的荧光标签分离出自己想要的细胞。进一步深入单细胞是比较棘手的一步，可能需要用到微流体设备，尤其是在细胞量较少的时候。

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将细胞分散到悬液中，会失去它们在组织里的位置信息。如果你想要了解单个细胞的邻居和环境线索，你就需要使用激光捕获显微切割技术。这种技术可以通过扫描组织切片，定位你想要研究的细胞，并将其提取出来。操作者需要非常小心，不要切到目的细胞流失含有RNA的细胞质，或者切掉部分细胞核，Voet指出。

数量最为稀少的细胞只能用毛细管等器具手动获取。分离到细胞之后，我们就可以进行表观遗传学分析了。现有技术一次只能进行一种类型的单细胞表观遗传学分析，你需要决定自己研究的是DNA、组蛋白还是染色质水平上的标签。

甲基化标签

DNA的胞嘧啶甲基化是一种经典的表观遗传学标签，这种标签通常意味着被沉默的基因组区域。之前人们一直在用重亚硫酸盐测序来进行甲基化分析，这是一种相当严酷的化学方法，主要是把所有未甲基化的胞嘧啶转变为尿嘧啶。经过PCR富集，这些改变用二代测序很容易检测出来。近来，一些研究团队将这一技术发展到了单细胞水平。

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Babraham研究所的Gavin Kelsey和Wolf Reik等人，开发了能分析单细胞中所有DNA甲基化的方法。为此，他们需要克服重亚硫酸盐处理造成的遗传物质损失。研究人员并没有像通常那样先片段化DNA，而是对单个细胞的裂解物进行重亚硫酸盐转化。然后他们对得到的DNA片段进行五次扩增以增加拷贝数。 “我们得到了很理想的单细胞甲基化图谱，” Kelsey说。（相关报道：Nature Methods发表单细胞重亚硫酸盐测序技术）

这个方案需要不少手动操作，但并不比常规重亚硫酸盐测序难多少。操作者们需要注意的主要问题是，每一步操作都有可能引入错误。Kelsey建议大家运行大量阴性对照，当你遇到问题的时候，就能很方便的找出问题所在。

Messerschmidt开发的检测法也是以重亚硫酸盐测序为基础的，不过检测的是特定位点的甲基化。他们通过限制性内切酶消化，来分离含有目的基因的片段，去除其他无关DNA。这是因为，重亚硫酸盐测序可能降解你想要分析的DNA，而这种方法能够避开这个问题生成更准确的结果，但是一次只能分析少数几个基因。“从某种意义上看，这其实比较像是一种诊断分析，”Messerschmidt说。Messerschmidt的方法可以更快得到结果，可以用来进行IVF胚胎筛选。当然，这一方案也可以用于其他数量稀少的细胞，比如小肠隐窝中的成体干细胞。

在使用这一方法时，裂解细胞需要非常小心，确保“不要都弄到管壁上”，Messerschmidt提醒道。“否则，液体快速蒸发之后你的DNA就粘在那里没用了。我们应当尽量保证DNA的良好状态，避免破坏DNA链。因为如果断裂发生在你想要研究的位置上，就会被解读成未甲基化的胞嘧啶而产生错误的结果。”Messerschmidt等人最近会在Nature Protocols上发表一篇文章，详细阐述这个方案的细节之处。

日本九州大学的Hiroyuki Sasaki及其同事开发了直接成像甲基化标签的技术，甲基化特异性原位杂交（MeFISH）。MeFISH用荧光探针结合甲基化的胞嘧啶，很容易就能在显微镜下看到这些标签，能从几百个细胞快速得到分析数据。虽然这个技术一次只能检测少量细胞，但它能够区分5-甲基胞嘧啶（5mC）和5-羟甲基胞嘧啶（5hmC）。上文提到的重亚硫酸盐测序法都不能区分这两种表观遗传学修饰。（原文：Sequence-specific microscopic visualization of DNA methylation status at satellite repeats in individual cell nuclei and chromosomes. Nucleic Acids Res.）

（下接：组蛋白和染色质水平上的单细胞表观遗传学分析）