华中科大用基因编辑治疗白血病

　　

生物通报道：急性白血病（AL）是最常见的血液系统恶性肿瘤，在遗传构成和临床结局表现出显著的异质性。由于对细胞遗传学/基因突变的了解加深，以及相应靶向疗法的引入，在某些白血病亚型的治疗方面已经获得了惊人的成功，但是，许多遗传高风险的亚型，目前用标准方案仍然是难以治疗的，并表现出预后不良。世界卫生组织和美国国家综合癌症网络越来越多地基于遗传倾向对AL进行分类，凸显了细胞遗传学/基因突变对于临床管理决策制定的深远影响。因此，迫切需要对这些AL患者的分子病理基础进行剖析，以开发新型的治疗策略。

近期，华中科技大学同济医学院的研究人员用基因编辑技术——TALENs，制备了同基因的白血病细胞克隆，并破坏了其中的FLT3基因，从而证明这种基因组编辑方法，是探索基因突变分子基础的强有力的平台。相关研究结果发表在最近的Nature子刊《Scientific Reports》。华中科技大学附属同济医学院周剑锋教授和Zhen Shang是本文共同通讯作者。延伸阅读：Science杂志2015年度热门：基因编辑。

相比较候选基因分析法，高通量测序技术所取得的进展，可让我们从全基因组的角度，以公正和全面的方式，对AL进行表征。在AL中高复发的基因突变的鉴定，为改进诊断方法、病人分层和靶向治疗，提供了宝贵的基础原理。然而，虽然已经出现了详尽的AL基因组草图，但是，阐明这些经常发生的基因突变与临床表型和治疗结果有何关联，还是比较困难的。确定这些个体遗传异常的临床相关性，是非常必要的。更重要的是，揭开白血病生物学关键的分子事件——人类基因组时代的重大挑战，从根本上来说对于未来的遗传医学也是非常重要的。

目前已有几种方法被广泛用于探索一个给定基因突变的分子机制。利用基因工程策略，研究人员已经建立了许多白血病动物模型，并为白血病的驱动因素提供了有说服力的见解。在未来几年中，基因工程动物模型将仍然是“研究遗传缺陷和临床表型之间的关联”最可靠的工具，并有助于设计和开发新的分子靶向策略。

然而，动物模型的方法有一些固有的缺点。例如，动物模型可能并不总能准确地模拟临床背景相关的白血病表型，产生和维护转基因模型的过程也很耗时和昂贵。另外，细胞株和主要样本为基础的模型，也被广泛用于探索导致肿瘤细胞表型的关键分子事件。主要样本之间遗传背景的巨大差异、转基因过表达/敲除的非生理水平和随机整合病毒载体引入的干扰，都限制了实际的分子机制。因此，在后基因组时代，迫切需要新的分析工具，来阐明白血病相关基因功能的分子机制。

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转录激活因子样效应物（TALE）核酸酶（TALENs）——一种高效的基因组编辑工具，是人工融合蛋白，含有的核酸内切酶FokI的催化结构域和一个设计的TALE DNA结合结构域——可识别特定的DNA序列。两个单独的TALENs结合到相邻的DNA序列，使FokI能够二聚化，靶DNA能够裂解，从而引入位点特异性的双链断裂（DSBs）。

随后，通过同源性指导修复或非同源末端连接（NHEJ）通路的细胞DNA修复被激活。迄今为止，基因组编辑技术已成功地用来诱导小鼠正常造血干细胞中的骨髓恶性肿瘤。然而，很少有研究采用这项技术，在白血病中调查个别基因异常引发的分子事件。

在这项研究中，研究人员制备了同基因的白血病细胞克隆，用TALENs技术破坏了其中的FLT3基因。并将具有单等位基因破坏的FLT3的同基因克隆，与等基因的野生型对照克隆和亲本的白血病细胞的转录表达、下游FLT3信号和增殖能力，进行了比较。研究人员采用RNA-seq，将突变型K562克隆及其相应的野生型对照组的全基因表达谱，进行了比较。

研究发现，FLT3的转录水平和配体依赖性自身磷酸化，在突变克隆中是下降的。TALENs介导的FLT3基因单倍不足，可损坏体外细胞增殖和集落形成。这种抑制作用是被维持在体内的，从而提高了移植有突变K562克隆的NOD/SCID小鼠的存活率。聚类分析表明，同基因克隆的基因表达模式，是由FLT3突变体的状态——而不是单个同基因克隆之间的偏差，所决定的。突变体和野生型之间差异表达的基因，揭示出突变K562克隆以及抑制的FLT3信号中无义介导的衰退通路的激活。

总而言之，这项研究支持，这种基因组编辑方法是探索基因突变的分子基础的一种强大和普遍适用的平台。

（生物通：王英）

注：周剑峰，男，教授/主任医师，博士生导师，血液内科主任。1997年毕业于同济医科大学附属协和医院血研所获得血液学博士学位。1998年6月至2001年7月在美国University of Illinois at Chicago 医学中心进修肿瘤分子医学。从事血液学临床工作25年，现任华中科技大学同济医学院附属同济医院血液科（国家级重点学科，国家临床重点专科）主任, 教育部重点实验室“同济医院肿瘤生物医学中心”副主任。国家杰出青年基金获得者。任中华医学会血液分会委员，实验诊断学组副组长，中国实验血液学会委员，中国抗癌协会血液分会常委。主要学术方向为血液系统恶性肿瘤的分子诊断和靶向治疗。

生物通推荐原文摘要：
TALENs-mediated gene disruption of FLT3 in leukemia cells: Using genome-editing approach for exploring the molecular basis of gene abnormality
Abstract: Novel analytic tools are needed to elucidate the molecular basis of leukemia-relevant gene mutations in the post-genome era. We generated isogenic leukemia cell clones in which the FLT3 gene was disrupted in a single allele using TALENs. Isogenic clones with mono-allelic disrupted FLT3 were compared to an isogenic wild-type control clone and parental leukemia cells for transcriptional expression, downstream FLT3 signaling and proliferation capacity. The global gene expression profiles of mutant K562 clones and corresponding wild-type controls were compared using RNA-seq. The transcriptional levels and the ligand-dependent autophosphorylation of FLT3 were decreased in the mutant clones. TALENs-mediated FLT3 haplo-insufficiency impaired cell proliferation and colony formation in vitro. These inhibitory effects were maintained in vivo, improving the survival of NOD/SCID mice transplanted with mutant K562 clones. Cluster analysis revealed that the gene expression pattern of isogenic clones was determined by the FLT3 mutant status rather than the deviation among individual isogenic clones. Differentially expressed genes between the mutant and wild-type clones revealed an activation of nonsense-mediated decay pathway in mutant K562 clones as well as an inhibited FLT3 signaling. Our data support that this genome-editing approach is a robust and generally applicable platform to explore the molecular bases of gene mutations.