CRISPR先驱Cell发表新成果

　　

生物通报道  来自哥伦比亚大学、加州大学伯克利分校的研究人员在新研究中揭示出了，大肠杆菌CRISPR-Cas系统监视及加工外源DNA的机制。这项研究工作发布在近期的《细胞》（Cell）杂志上。

哥伦比亚大学的Eric C. Greene博士及加州大学伯克利分校的Jennifer Doudna博士是这篇论文的共同通讯作者。Doudna是CRISPR技术的共同开发者，曾因这一技术获得了“生命科学突破奖”（Breakthrough Prize），是CRISPR专利的有力竞争者（延伸阅读：Nature：揭示CRISPR/Cas9的DNA靶向切割机制 ）。

许多原核生物都具有由CRISPR位点和Cas基因组成的一种RNA引导适应性免疫系统。CRISPR位点最初是在大肠杆菌中被发现，其是由一些长度为29个核苷酸的“重复序列”（repeat）组件构成,这些重复序列被长度为32个核苷酸的“间隔序列”(spacer)所间隔。后来人们认识到，这些间隔序列来源于外源遗传元件，表明CRISPR位点有可能充当了一种RNA引导的免疫系统。现在已经知道，CRISPR-Cas免疫是通过将一些短DNA片段整合到CRISPR位点内而提供，这些间隔序列记录了过去的感染史。CRISPR位点转录生成的转录物被加工为较短的CRISPR-RNAs (crRNAs)，每个都包含着与以往遭遇过的外源DNA元件互补的序列。

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CRISPR-Cas系统可分为I型、II 型和III型三种，分别基于存在的标记Cas3、Cas9或Cas10基因进行区分。I型最常见，我们对I型CRISPR-Cas系统大部分的认识都来自对大肠杆菌Cascade（实现病毒防御的CRISPR相关复合物）的研究，Cascade由 5种蛋白Cse1、Cse2、Cas7、Cas5e和Cas6e构成。这些蛋白质在一段61个核苷酸 crRNA上进行组装，生成一个405- kDa的复合物。crRNA包含一段32个核苷酸的间隔序列，将Cascade引导至外源DNA中的前间隔序列(protospacer)处，导致形成一种R-环中间产物。Cascade随后招募Cas3降解这一DNA。

Cascade必须将细菌染色体和外源DNA中的间隔序列区分开来。这种区分被认为是通过识别前间区序列邻近基序(PAM)来实现的，PAM靠近外源DNA中的前间隔序列，而不存在于CRISPR位点中。严格的序列需求代表了一种潜在的弱点，因为PAM或前间隔序列突变都可以使得外源DNA逃避CRISPR-Cas免疫。但细菌可以通过采用一种正反馈环来更新CRISPR位点快速地恢复免疫。这一待发获取间隔序列（Priming）的机制仍然是CRISPR-Cas免疫了解最少的一个方面。待发获取间隔序列要求Cascade有一段至少与逃避靶标部分互补的crRNA，表明Cascade必须能够确定靶标的位置，即便它们具有足以逃避免疫的突变。还要求有Cas3和Cas1-Cas2复合物，将新序列整合到CRISPR位点内。

在这篇Cell文章中，研究人员利用单分子成像技术在单个Cascade复合物寻找噬菌体λ基因组内前间隔序列时显影了它们。研究揭示出了PAM依赖和非依赖性搜索信号通路。这一PAM依赖性信号通路高度有效，使得Cascade能够招募Cas3，从而特异性地降解靶基因组。PAM非依赖性的信号通路则没那么有效，但Cascade仍然可以紧密结合DNA，确保了它可以在待发获得间隔序列之前启动一系列的分子事件。通过这一信号通路，Cas3招募变得严格依赖于Cas1-Cas2，Cas1-Cas2也抑制了Cas3的核酸酶活性，使得Cas3能够沿着外源DNA向任意方向快速易位。

这些结果确立了Cas1-Cas2是在逃避靶标处招募及调控Cas3的一个反式作用因子。基于研究结果，作者们提出了一种Cascade、Cas1、Cas2和Cas3协同作用加工且使得外源遗传元件丧失功能的机制。

（生物通：何嫱）

生物通推荐原文摘要：

Surveillance and Processing of Foreign DNA by the Escherichia coli CRISPR-Cas System

CRISPR-Cas adaptive immune systems protect bacteria and archaea against foreign genetic elements. In Escherichia coli, Cascade (CRISPR-associated complex for antiviral defense) is an RNA-guided surveillance complex that binds foreign DNA and recruits Cas3, a trans-acting nuclease helicase for target degradation. Here, we use single-molecule imaging to visualize Cascade and Cas3 binding to foreign DNA targets. Our analysis reveals two distinct pathways dictated by the presence or absence of a protospacer-adjacent motif (PAM). Binding to a protospacer flanked by a PAM recruits a nuclease-active Cas3 for degradation of short single-stranded regions of target DNA, whereas PAM mutations elicit an alternative pathway that recruits a nuclease-inactive Cas3 through a mechanism that is dependent on the Cas1 and Cas2 proteins. These findings explain how target recognition by Cascade can elicit distinct outcomes and support a model for acquisition of new spacer sequences through a mechanism involving processive, ATP-dependent Cas3 translocation along foreign DNA.