我学者用CRISPR让猪生产人血白蛋白

近期，我国多家机构的研究人员，通过使用最新的基因组编辑工具CRISPR/Cas9，将人血白蛋白cDNA敲入猪Alb基因位点，生产出了重组人血清白蛋白（rHSA）。相关研究结果发表在最近的《Scientific Reports》。

　　

生物通报道：在许多情况下，在大型家养动物中进行精确的基因组修饰，是可取的。在过去，这只能通过冗长而繁琐的克隆程序才能进行。近期，来自军事医学科学院放射与辐射医学研究所、第三军医大学、南京大学、国家蛋白质科学中心和广州医科大学附属第一医院的研究人员，通过使用最新的基因组编辑工具CRISPR/Cas9，将人血白蛋白cDNA敲入猪Alb基因位点，产生了重组人血清白蛋白（rHSA）。相关研究结果发表在最近的《Scientific Reports》。延伸阅读：用转基因番茄工业化生产天然化合物。

国家“****”获得者、北京蛋白质组研究中心副主任张普民教授和第三军医大学基础部实验动物学教研室主任魏泓教授，是本文共同通讯作者。南京大学模式动物研究中心的黄行许教授也是本文共同作者之一。

人血清白蛋白（HSA）是血浆中含量最丰富的蛋白质，在人体生理学中起着关键的调节作用，包括血浆胶体渗透压的维护、调节体液分布、小分子运输等等，是一些严重疾病（如肝功能衰竭和外伤性休克）的常规处方药。由于人类血液供应不足以及与人类血液相关的风险，科学家们一直都在寻求人血清蛋白的替代生产。

之前，有科学家以Albumin-GFP融合的形式进行显性转基因表达，在猪中生产出了重组HSA。然而，在转基因的方法当中，由于存在内源性的猪白蛋白，因此，rHSA的分离和纯化都是有疑问的。

在这项研究中，研究人员利用CRISPR/Cas9系统在基因组修饰中的力量，通过将人血清白蛋白cDNA敲入猪的白蛋白基因位点，在猪当中生产重组人血清白蛋白。

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通过将人ALB cDNA加SV40 polyA信号序列（总长2368bp），注入猪Alb位点下游起始密码子，研究人员希望人类ALB能在猪内源性白蛋白基因的转录调控下表达，同时阻止猪内源性白蛋白的表达。研究人员设计了一个sgRNA靶定起始密码子区域，并生成一段目标片段（同源重组的供体），在两侧插入1 kb的同源序列。

因为用于供体的5′同源序列达到了起始密码子，它包含sgRNA序列，从而可以在同源重组后被sgRNA靶定作为供体或敲入基因。为了防止这种情况发生，研究人员在起始密码子之前向sgRNA序列中插入了6 bp（gccacc）。sgRNA是在体外转录、纯化，并连同Cas9 mRNA和包含靶片段的循环载体，一起注入受精卵。卵母细胞的来源是巴马小型猪。在植入发情期的同步雌性猪之前，注射的胚胎被培养了1到2 小时。约300只胚胎被植入10名雌性猪体内，其中5只猪怀孕，并产下了16只活的幼崽。幼崽在标准的照顾下，并没有出现任何不寻常健康问题的迹象。

经过基因型分析，研究人员发现，16只猪仔携带了预期的敲入基因，这些猪仔血液中存在人血清蛋白。此外，这个敲入的等位基因被成功地传递给后代。精密基因组工程的这一成功，有望促进科学家探索猪和其他大型家养动物，用以生产生物医学产品，或选育具有更理想性状的家畜品种。

（生物通：王英）

注：张普民博士长期从事人类疾病包括肝脏疾病和癌症的分子遗传学研究，在细胞周期，遗传发育，基因组稳定性等方面有较深的造诣。2011年加入北京蛋白质组研究中心后，展开了蛋白质组学的相关研究。其实验室开发了在成鼠肝内进行基因操作的技术方法，为功能发掘肝蛋白质组奠定了基础。目前正在进行肝转录因子和泛素连接酶的功能筛选。课题组成立于2011年11月，由新引入的美国贝勒医学院张普民教授担任课题组负责人。

魏泓，男，博士，教授，博士生导师，现任第三军医大学基础部实验动物学教研室主任。1988年7月至1992年7月任第三军医大学训练部实验动物所讲师；1992年9月至1996年7月任第三军大学训练部实验动物学教研室副主任；1993年9月至1996年9月任第三军医大学训练部实验动物学教研室副教授、主任；1998年9月任第三军医大学训练部实验动物学教研室教授、主任；1999年9月任博士生导师；2005年3月至今任第三军医大学基础部实验动物学教研室主任。

生物通推荐原文摘要：
Production of Human Albumin in Pigs Through CRISPR/Cas9-Mediated Knockin of Human cDNA into Swine Albumin Locus in the Zygotes
Abstract: Precise genome modification in large domesticated animals is desirable under many circumstances. In the past it is only possible through lengthy and burdensome cloning procedures. Here we attempted to achieve that goal through the use of the newest genome-modifying tool CRISPR/Cas9. We set out to knockin human albumin cDNA into pig Alb locus for the production of recombinant human serum albumin (rHSA). HSA is a widely used human blood product and is in high demand. We show that homologous recombination can occur highly efficiently in swine zygotes. All 16 piglets born from the manipulated zygotes carry the expected knockin allele and we demonstrated the presence of human albumin in the blood of these piglets. Furthermore, the knockin allele was successfully transmitted through germline. This success in precision genomic engineering is expected to spur exploration of pigs and other large domesticated animals to be used as bioreactors for the production of biomedical products or creation of livestock strains with more desirable traits.