吉林大学用CRISPR抑制HIV感染

　　

生物通报道：CRISPR是生命进化历史上，细菌和病毒进行斗争产生的免疫武器，自2012年以来，研究人员常用这种强大的“基因组编辑”技术，对生物的DNA序列进行修剪、切断、替换或添加，迅速成为生命科学最热门的技术。近来，相继有研究利用CRISPR技术来对抗艾滋病，例如：利用CRISPR/Cas9技术对抗艾滋病,Nature子刊重大成果：用CRISPR技术根除艾滋病毒,PNAS艾滋病研究突破：CRISPR技术根除病毒。

十月二十三日，来自吉林大学和斯坦福大学的研究人员，利用一种工程设计的CRISPR Csy4 RNA内切核糖核酸酶，来抑制HIV-1病毒感染。相关研究结果发表在国际学术期刊《PLOS ONE》。吉林大学第一医院的胡继繁教授和李薇教授是本文共同通讯作者。

尽管艾滋病治疗已经取得了一定进展，但是HIV-1——艾滋病的病原体，因其全球性蔓延（特别是发展中国家），仍然是一个主要的公共健康威胁。目前世界上有3000万成年人和儿童感染HIV，每年有180万新的HIV感染病例。而且，当前艾滋病的治疗仍然非常昂贵，更重要的是，它不能被完全治愈，从而迫切需要寻求新的策略，找到一种控制HIV感染的疗法。

细胞内的基因疗法，已经被开发作为控制HIV感染的一种很有前景的方法，包括siRNA、胞内抗体、HIV进入靶定、内切核酸酶以及定制的Cre重组酶。Cre重组酶是来源于P1噬菌体的一种酪氨酸重组酶。这种酶使用一种拓扑异构酶I样的机制，在靶DNA中执行位点特异性的重组。38kDa重组酶可识别一段34bp的双链发夹NDA序列，称为loxP，并催化两个IoxP位点之间的重组事件。loxP位点包含两段13bp的回文序列，侧翼是一段8bp的间隔区。进化的重组酶Tre，当在初生CD4+ T细胞中表达时，可切除受感染细胞基因组的整合的HIV前病毒DNA。

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CRISPR Csy4是一种RNA核糖核酸内切酶，可处理假单胞菌中的CRISPR转录本（pre-crRNAs）。Csy4可结合其位于crRNA重复大沟中的同源RNA，并利用活性部位中的丝氨酸和组氨酸残基，来切割pre-crRNAs。

考虑到Cre重组酶的成功，该研究小组想探讨Csy4 RNA内切核糖核酸酶的潜力。Csy4是一种位点特异性的RNA内切核糖核酸酶，可识别一段18bp的同源发夹序列（Cy18）。该研究小组假设，我们是否可以通过设计Csy4。来破坏HIV-1 RNA。定制Csy4来识别存在于HIV-1 5’-LTR和3’-LTR中的序列，将是靶定HIV-1的一种新方法。

因此，在这项研究中，研究人员检测了Csy4防御系统作为一种治疗工具靶定HIV-1 LTR的潜力。他们将人密码子优化的Csy4内切核糖核酸酶与VPR（一种HIV-1病毒形成前整合复合物蛋白）融合。研究人员对一种HIV-1细胞模型进行了改造，可对活性病毒产物进行定量检测。他们发现，在两个靶细胞系中（SupT1, Ghost），反式表达的PR-Csy4几乎完全阻断了病毒感染。在MAGI细胞检测中（在来自整合前病毒的tat基因的控制下，HIV-1 LTR β-牛乳糖苷酶被表达），VPR-Csy4可显著阻断前病毒激活的HIV-1 reporter的活性。

总之，这项概念验证研究表明，Csy4核糖核酸内切酶是一种很有前景的工具，可进一步定制用于靶定HIV-1。

（生物通：王英）

注：胡继繁，教授，博士研究生导师，肿瘤中心基础研究室学术带头人。1992 美国康奈尔大学营养生物化学博士，在肿瘤和干细胞表观遗传学研究领域取得了诸多原创性成果，并发表在Science, Journal of Cell Biology, JCI, EMBO J, Hepatology, Oncogene等高水平杂志上。迄今，发表SCI源刊论著40余篇，其中第一或通讯作者论著20余篇，IF大于5共16篇，总被引频次大于500次；获得美国授权专利3项；研究方向为干细胞和表观遗传学，包括IGF2/H19基因印记机理以及表观遗传性状的修饰与癌症治疗；诱导多能干细胞（ips）重编程的表观遗传学机制等。

李薇，吉林大学二级教授、主任医师，博士生导师，吉林大学第一医院肿瘤中心主任，吉林大学白求恩医学部肿瘤学系主任，吉林大学第一医院肿瘤教研室主任、内科教研室主任，曾赴美国Louisville 大学、美国Mount Sinai Medical Center深造两年。

生物通推荐原文摘要：
Inhibition of HIV-1 Viral Infection by an Engineered CRISPR Csy4 RNA Endoribonuclease
Abstract：The bacterial defense system CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats) has been explored as a powerful tool to edit genomic elements. In this study, we test the potential of CRISPR Csy4 RNA endoribonuclease for targeting HIV-1. We fused human codon-optimized Csy4 endoribonuclease with VPR, a HIV-1 viral preintegration complex protein. An HIV-1 cell model was modified to allow quantitative detection of active virus production. We found that the trans-expressing VPR-Csy4 almost completely blocked viral infection in two target cell lines (SupT1, Ghost). In the MAGI cell assay, where the HIV-1 LTR β-galactosidase is expressed under the control of the tat gene from an integrated provirus, VPR-Csy4 significantly blocked the activity of the provirus-activated HIV-1 reporter. This proof-of-concept study demonstrates that Csy4 endoribonuclease is a promising tool that could be tailored further to target HIV-1.