北大陈良怡最新文章：活细胞超高分辨率成像技术

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生物通报道：进入21世纪以来出现了多种超高分辨率荧光成像技术, 打破了光学分辨率的极限, 将光学分辨率提高到几十纳米的尺度, 可以用来观察精细的细胞内器官的结构和位置信息, 因此被广泛地应用于生物学研究中. 近期来自北京大学分子医学研究所的陈良怡发表综述，介绍了运用结构光照明的活细胞超高分辨率成像技术.

超高分辨率荧光成像技术主要分为三大类, 基于受激发射光淬灭(stimulated emission depletion, STED)技术, 基于单分子开关的超高分辨率定位技术(包括光激活定位显微成像术(photoactivated localization microscopy, PALM)和随机光学重构显微成像术(stochastic optical reconstruction microscopy, STORM))和基于结构光成像的超分辨率技术(structured illumination microscopy, SIM). 2014年, 诺贝尔化学奖授予了STED技术的发明人, 德国马克斯普朗克生物物理化学研究所Stefan W. Hell教授和PALM技术的发明人美国霍华德·休斯医学研究所Eric Betzig教授, 表彰他们在超分辨率荧光显微成像技术方面的重大贡献.

诺贝尔化学奖并没有表彰基于结构光成像的SIM 超分辨率技术, 一个原因是其发明人Mats Gustafsson于2011年51岁时因癌症去世, 另一个原因是线性SIM的分辨率只有传统显微镜的两倍, 大约为100 nm. 尽管STED和PALM/STORM类型的超高分辨率成像可以得到更高的分辨率, 它们的缺点也很明显: 需要很强的激发光来照明样品.

本质上STED和PALM/STORM类型的超高分辨率成像不适合活细胞长时间成像, 而比较适合于死细胞和固定样本的成像. 相对应的, SIM 成像的方法非常有效地利用荧光分子所发出的光子, 有可能成为活细胞超高分辨率成像的利器. 针对这个方向, Eric Betzig 教授的团队和中国科学院生物物理研究所、美国国立科学研究院和哈佛医学院等的科学家们合作探索, 发展了新型的SIM成像技术, 使活细胞超高分辨率成像成为现实. 这一研究成果于2015年8月28日在美国Science杂志上以封面文章发表.

在传统的SIM显微镜中, 物体被非均匀的结构光(类似于条纹码)所照明. 在实验中, 不同相位和方向的结构光依次照明物体, 它们和物体在不同角度混频所产生的摩尔条纹被相机依次采集并解码生成超高分辨率的图像. 最终重建的SIM图像具有高于传统显微镜图像2倍的空间分辨率. 通过利用商业化的超高数值孔径的油镜(NA 1.7), 全内反射的照明模式(total internal reflection fluorescence, TIRF)和空间光调制器(spatial light modulator, SLM)来快速产生光栅, 李栋博士和Betzig教授实现了线性SIM, 其分辨率达到82 nm. 在这种模式下, 照明用的强度仅为其他超高分辨率成像所用强度的3%, 双色成像的时间分辨率为1.67 s, 也是相应的超高分辨率成像所用时间的1/15. 利用这个技术, 他们观察了活细胞内的网格蛋白小窝以及细胞内不同的骨架蛋白的精细动态变化过程.

进一步的提高分辨率是通过非线性SIM显微成像模式来实现的. 与以往的非线性SIM相比, 新技术在两个方面做了改进, 使用了新型可开关荧光探针和新型开关结构光的模式. 合作者中国科学院生物物理所徐平勇课题组发展了一种新型反复光激活荧光蛋白Skylan-NS. 对比现有的其他反复光激活的荧光蛋白, 该蛋白具有高对比度、高光学稳定性等特性, 能够实现在活细胞上的低光强照明, 高速反复开关以及发射出足够多的光子数.

另一方面, Betzig 研究小组发展了新的的结构光激活非线性SIM的模式, 其关键在于一开始用结构光只激活样品里的一部分荧光蛋白分子, 得到超高分辨率的信息. 然后通过另一束结构光用于反激活分子, 再读出额外的信息. 这样, 完成一幅完整的超高分辨率采样只需要拍25张图, 其重组出来的最终空间分辨率可以达到62 nm, 时间分辨率也可以达到350 ms. 这个方法可以用于观察快速运动的细胞器, 例如, 追踪细胞膜上的50~100 nm大小的细胞膜穴样内陷(caveolae)的运动. 最后, Betzig研究小组将新的非线性SIM成像技术和他们组之前发明的晶格层状光显微镜(lattice lightsheet)结合, 在三维尺度上超高分辨率的观察线粒体和高尔基的相对运动的动态过程, 实现了超高分辨率和活细胞成像的完美结合.

眼见为实, 在活细胞中实时观察到精细结构的动态变化一直以来是生物学家的梦想. 新的结构光成像手段大大提高了SIM的时间和空间分辨率, 有望为解析细胞内部的工作机理提供重要的手段.

原文检索：

陈良怡. 运用结构光照明的活细胞超高分辨率成像技术. 中国科学: 生命科学, 2015, 45: 903–904
Chen L Y. Superresolution imaging of live cell dynamics using structural illumination microscopy. SCIENTIA SINICA Vitae, 2015, 45: 903–904, doi: 10.1360/N052015-00275