Nature发布CRISPR/Cas研究新发现

　　

生物通报道  CRISPR/Cas9蛋白系统是细菌适应性免疫的一个重要组成部分，近年来因其作为一种基因组编辑工具显示出巨大的潜力而引人注目。通过研究这一系统，研究人员发现它有点像俄罗斯套娃，解锁一个秘密可揭示出其中的另一个秘密。
 
来自加州大学伯克利分校的生物化学家Jennifer Doudna一直走在解锁CRISPR/Cas秘密的最前沿，通过分析先进光源（Advanced Light Source）实验室获得的数据，Doudna和她的研究小组发现了细菌能够从病毒和其他外源入侵物中获得遗传信息将之用于自身免疫系统的结构基础。

Doudna说：“通过研究大肠杆菌中Cas1和Cas2酶的X-射线晶体结构，我们现在可以看到在Cas1和Cas2捕获外源DNA后是如何处理及弄弯它的。认识Cas1和Cas2在细菌基因组中的功能为我们提供了研究或纠正人类基因组中一些问题的可能的机制。”

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当我们人类将细菌视作为敌人时，细菌也同样有敌人——病毒及质粒。为了保护自身，细菌形成了一种以CRISPR为中心的适应性免疫系统。CRISPR的DNA元件是由“重复”元件——30-60个核苷酸长度的碱基对序列所构成，这些重复序列被长度变化为30-60个核苷酸的“间隔序列”(spacer)组件所间隔。CRISPR和Cas蛋白的组合，使得细菌能够将间隔序列转变为定制的RNA分子来沉默外源入侵物DNA的关键组成部分。CRISPR/Cas系统还使得细菌能够基于整合到细菌CRISPR位点中的外源DNA间隔元件来“记住”以往的感染，在未来获得对相似入侵的免疫力。

近期Doudna和她的研究小组发现，Cas1和Cas2是CRISPR/Cas系统中细菌“偷取”及“记忆”外源DNA遗传信息的必需的两种蛋白，但对于这一任务是如何完成的却并不清楚。现在，利用美国能源部科学用户设备办公室的大分子晶体学光束线(8.3.1)，Doudna和她的研究小组发现Cas1和Cas2充当了分子尺，不仅识别了外源DNA，还在偷取过程中精确测量了DNA。

论文主要作者、Doudna研究组成员James Nuñez 说：“从我们以往的工作中，我们知道了Cas1和Cas2捕获的是双链DNA而非单链DNA，但我们没有想到的是当我们在大肠杆菌中解析这一晶体结构时，发现Cas1分开了双链DNA的末端。这是一个至关重要的发现，因为我们现在知道了可以利用在末端包含一个中心双链DNA区域和单链DNA的DNA底物来编程Cas1和Cas2，然后有可能沿着靶基因组将这些DNA底物插入到特定位点来实现编辑目的。”

此外，近日来自中科院生物物理研究所王艳丽研究组的研究人员，也揭示出了CRISPR-Cas系统依赖于PAM获取间隔序列的结构基础及机制。研究工作发布在《细胞》（Cell）杂志上（延伸阅读：中科院Cell发表CRISPR-Cas研究新成果）。

研究人员通过深入的研究，解析了Cas1-Cas2与多种类型DNA的复合物的晶体结构，证明了被Cas1-Cas2所获取的外源核酸片段是以双叉的构象存在的；Cas1-Cas2通过两个酪氨酸固定并且准确量取双链部分，并以序列特异性的方式识别3’单链的中PAM的互补序列（5’-CTT-3’），由Cas1发挥活性作用，分别在两端的3’ overhang切割出5nt的长度，产生了一段33nt长度的DNA片段；在这个过程中，与外源核酸片段的结合，使得Cas1-Cas2经历了类似于蝴蝶飞舞时“翅膀上扬”到“翅膀水平“的构象变化，最终通过一种类似切割-拷贝的方式将获取的外源核酸片段插入到了自身的CRISPR位点。

该研究发现了Cas1-Cas2识别外源入侵DNA分子机制，揭示了外源核酸片段的长度是如何确定的，同时也解释了该阶段中的核心蛋白Cas1和Cas2各自的功能。因此，该成果为揭示原核生物这一新的抵御病毒及遗传物质的入侵的机制奠定了重要的理论基础。

（生物通：何嫱）

生物通推荐原文摘要：

Foreign DNA capture during CRISPR–Cas adaptive immunity

Bacteria and archaea generate adaptive immunity against phages and plasmids by integrating foreign DNA of specific 30–40-base-pair lengths into clustered regularly interspaced short palindromic repeat (CRISPR) loci as spacer segments1, 2, 3, 4, 5, 6. The universally conserved Cas1–Cas2 integrase complex catalyses spacer acquisition using a direct nucleophilic integration mechanism similar to retroviral integrases and transposases7, 8, 9, 10, 11, 12, 13. How the Cas1–Cas2 complex selects foreign DNA substrates for integration remains unknown. Here we present X-ray crystal structures of the Escherichia coli Cas1–Cas2 complex bound to cognate 33-nucleotide protospacer DNA substrates. The protein complex creates a curved binding surface spanning the length of the DNA and splays the ends of the protospacer to allow each terminal nucleophilic 3′-OH to enter a channel leading into the Cas1 active sites. Phosphodiester backbone interactions between the protospacer and the proteins explain the sequence-nonspecific substrate selection observed in vivo2, 3, 4. Our results uncover the structural basis for foreign DNA capture and the mechanism by which Cas1–Cas2 functions as a molecular ruler to dictate the sequence architecture of CRISPR loci.