黄行许教授连发CRISPR研究成果

南京大学模式动物研究所的黄行许（Xingxu Huang）教授，是近年来基因组编辑领域的风云人物之一。近期，黄行许教授课题组接连在CRISPR/Cas9研究中取得突破性成果，相关论文发表在Nature Methods、Cell Research、Scientific Reports和Human Molecular Genetics等权威期刊。

　　

生物通报道：南京大学模式动物研究所的黄行许（Xingxu Huang）教授，是近年来基因组编辑领域的风云人物之一。其实验室不仅首次在世界上利用CRISPR/Cas9进行了大鼠的条件性基因敲除，还通过原核注射实现了世界上首次猴基因敲除，这些成果在国际上受到广泛的瞩目。近期，黄行许教授课题组接连在CRISPR/Cas9研究中取得突破性成果，相关论文发表在Nature Methods、Cell Research、Scientific Reports和Human Molecular Genetics等权威期刊。

在5月28日的Nature Methods杂志上，黄行许教授研究小组则与Wellcome Trust Sanger研究所的William C Skarnes展开合作，调查了Cas9基因改良小鼠的脱靶突变情况。他们采用全基因组测序，更全面地评估了注入Cas9与Cas9切口酶诱导的损害。证实在诱导出目的突变等位基因的同时，在受精卵中Cas9核酸内切酶诱导的非目的突变是非常稀少的。相关阅读：南京大学黄行许Nature子刊CRISPR-Cas9研究新文章。

6月5日发表在Cell Research杂志的一项研究中，黄行许课题组与南京大学刘江怀(Jianghuai Liu)教授研究小组合作，基于近期研究人员采用细菌II型CRISPR/Cas9系统，开展RNA引导基因编辑和转录编程研究中取得的一些技术突破，对非切割性dCas9/sgRNA作为序列特异性顺式调控元件靶向平台在人类细胞中的应用，进行了测试。

9月10日，黄行许课题组与西北农林科技大学、榆林学院等处的研究人员合作，将靶定两个功能基因（MSTN和FGF5）的Cas9 mRNA和sgRNAs，共注射到单细胞阶段的山羊胚胎中，成功地产生了一个或两个基因被修饰的转基因山羊。研究人员对成纤维细胞、以及建立者动物和死亡动物的身体组织和睾丸中靶基因的打靶和脱靶突变进行了详细分析。结果表明，他们在大型动物中同时获得了几个位点的编辑，从而表明CRISPR/Cas9系统有潜力成为一种强大而高效的农业动物基因工程工具，因此用于繁殖将是极为重要和适用的。相关阅读：我科学家用CRISPR获得转基因山羊。

另外，2月份在Scientific Reports杂志发表的另一项研究中，黄行许与第三军医大学的魏泓(Hong Wei)教授合作，采用将Cas9/sgRNA注入到受精卵中的方式有效构建出了转基因猪。在受精卵中共同注入Cas9 mRNA和sgRNA已被证实是在不同物种中实现基因组改造的一种有效的基因编辑策略。

10月13日，黄行许教授联手云南中科灵长类生物医学重点实验室、中科院动物研究所和中科院昆明动物研究所的研究人员，在国际著名期刊《Human Molecular Genetics》又发表一项CRISPR/Cas9研究成果，题为“CRISPR/Cas9-mediated Dax1 knockout in the monkey recapitulates human AHC-HH”。黄行许教授、云南中科灵长类生物医学重点实验室的季维智研究员和南京医科大学特聘教授沙家豪，是本研究的共同通讯作者。

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这项研究指出，DAX1基因突变可引发X连锁先天性肾上腺发育不全（AHC）和促性腺激素分泌不足的性腺功能低下症（HH），分别表现为原发性肾上腺皮质功能不全和不完整或缺少性成熟。来自Dax1基因敲除小鼠模型的结论，只能为AHC/HH疾病提供有限的见解。该研究小组之前在食蟹猴中成功实现了CRISPR/Cas9介导的基因组打靶。在这项研究中，研究人员描述了一个雄性胎猴，用CRISPR/Cas9进行基因组打靶，在其大多数身体组织和性腺中产生了Dax1无效突变。这只DAX1缺陷猴表现出肾上腺发育缺陷和异常的睾丸结构。Sertoli细胞的形成没有受影响。这种表型与AHC-HH患者（DAX1突变引发的）中观察到的现象非常相似。

研究人员进一步检测了Wnt/β-catenin-VEGF信号在胎猴Dax1缺陷睾丸中的上调，从而将缺乏DAX1时信号通路的异常激活，视为AHC-HH的一个机制。这项研究，对于DAX1在HH中的作用，提供了新的见解，并为“通过CRISPR/Cas9介导的基因打靶制备人类疾病猴模型”提供了原理验证。

（生物通：王英）

注：黄行许，南京大学模式动物研究所博士生导师。主要研究方向为DNA甲基化对配子重编程的影响；基因操作技术的研发和基因工程动物模型的构建。其实验室通过CRISPR/Cas9介导的同源重组，实现了世界上首次利用CRISPR/Cas9进行大鼠的条件性基因敲除，成功利用突变的Cas9结合双sgRNA技术把脱靶效应降低到检测不到的水平，通过原核注射实现了世界上首次猴的基因敲除。曾经获得美国国立卫生研究院博士后培训基金；主持和参加多项国家自然科学基金和“973”项目，在PNAS，PLoS Biology，Nature Cell Biology，Current Biology，PLoS Genet 等期刊发表多篇论文。

生物通推荐原文：
Off-target mutations are rare in Cas9-modified mice. Nat Methods. 2015 Jun;12(6):479. doi: 10.1038/nmeth.3408. No abstract available.

Functional annotation of cis-regulatory elements in human cells by dCas9/sgRNA. Cell Res. 2015 Jul;25(7):877-80. doi: 10.1038/cr.2015.70. Epub 2015 Jun 5.

Generation of fertile offspring from Kit(w)/Kit(wv) mice through differentiation of gene corrected nuclear transfer embryonic stem cells. Cell Res. 2015 Jul;25(7):851-63. doi: 10.1038/cr.2015.74. Epub 2015 Jun 19.

Generation of gene-modified goats targeting MSTN and FGF5 via zygote injection of CRISPR/Cas9 system. Sci Rep. 2015 Sep 10;5:13878. doi: 10.1038/srep13878.

CRISPR/Cas9-mediated Dax1 knockout in the monkey recapitulates human AHC-HH. Hum Mol Genet. 2015 Oct 13. pii: ddv425.