华中农大：利用I型及III型CRISPR-Cas系统实现基因组编辑

CRISPR-Cas系统广泛存在于细菌和古细菌中，近年来科学家们针对它们的分子机制开展研究促使开发出了基于II型系统的一些基因编辑技术。然而，却未有研究报道利用I型及III型系统来实现基因组编辑。

　　

生物通报道  CRISPR-Cas系统广泛存在于细菌和古细菌中，近年来科学家们针对它们的分子机制开展研究促使开发出了基于II型系统的一些基因编辑技术(延伸阅读：中科院Cell发表CRISPR-Cas研究新成果 )。然而，却未有研究报道利用I型及III型系统来实现基因组编辑。

来自华中农业大学的研究人员报告称，他们开发出了一种利用I型和III型CRISPR进行基因组编辑的方法，实现了对冰岛硫化叶菌(Sulfolobus islandicus)的遗传操控。这项研究发布在10月13日的《Nucleic Acids Research》杂志上。

华中农业大学的佘群新（Qunxin She）教授和梁运祥（Yun Xiang Liang）教授是这篇论文的共同通讯作者。博士生李英俊（Yingjun Li）为论文第一作者。

CRISPR-Cas在原核生物抗病毒防御中发挥重要功能，分别存在于90%和40%的古细菌及细菌基因组中。当前，CRISPR-Cas主要被分为3个主要类型：I型，II型和III型。CRISPR-Cas系统按三个步骤来发挥功能。首先，识别来自入侵遗传元件的一段DNA（前间隔序列，protospacer），并将其插入到前导序列之后的CRISPR位点，变为CRISPR序列第一个新间隔序列。第二步，前导区转录为CRISPR序列，形成的一条长前体转录物被加工为成熟crRNAs。最后，crRNAs与Cas蛋白形成一种核糖核蛋白复合体(crRNP)，通过crRNA与前间隔序列之间的序列互补来识别入侵遗传元件，通过DNA或RNA干扰来靶向破坏它们的核苷酸。

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在这三种主要的CRISPR-Cas系统中，II型系统进行DNA干扰只需要一个称作为Cas9的蛋白。Cas9具有多个结构域，在DNA干扰中与两条小RNA：成熟crRNA和tracrRNA一起发挥作用。在获得这一发现后不久，简单的II型CRISPR系统便被利用于高等真核生物中在细胞和生物体水平上实现基因组编辑，在过去的几年里CRISPR-Cas9技术在全球的应用呈爆炸性增长，当前已被广泛用于许多不同的真核生物。此外，研究人员还在各种细菌中证实了CRISPR-Cas介导的细胞杀伤，并探讨了利用遗传工程I型和III型CRISPR-Cas系统或改变细菌宿主內源免疫系统来选择性除去特异细菌物种。CRISPR-Cas系统还可用于促进生成基因组岛删除突变。但目前尚未有报道利用I型及III型系统来实现基因组编辑。

在这篇新文章中研究人员报告称，开发出了一种利用I型和III型CRISPR进行基因组编辑的方法，实现了对冰岛硫化叶菌的遗传操控。这种方法是基于原核生物自身具有CRISPR系统。他们构建出了携带人工迷你CRISPR簇和包含非靶向序列供体DNA的一种新型基因组编辑质粒(pGE)。将pGE质粒转化到宿主细胞后，人工CRISPR簇提供的crRNA会与内源CRISPR系统提供的Cas蛋白形成核酸蛋白复合体crRNP，对靶标基因进行DNA干涉。利用这一策略，研究人员生成了不同类型的突变，包括删除、插入和点突变。

研究人员表示，这种方法可简便适用于所有具有内源CRISPR-Cas系统的细菌和古细菌，同源重组的参与极大程度上避免了脱靶效应，增强了编辑特异性；更高的编辑效率，筛选阳性率高；流程简单，操作周期短，大大减轻了原核生物基因组编辑的工作量。当前该方法已申请了新型发明专利。

（生物通：何嫱）

生物通推荐原文摘要：

Harnessing Type I and Type III CRISPR-Cas systems for genome editing.

CRISPR-Cas (clustered regularly interspaced short palindromic repeats-CRISPR-associated) systems are widespread in archaea and bacteria, and research on their molecular mechanisms has led to the development of genome-editing techniques based on a few Type II systems. However, there has not been any report on harnessing a Type I or Type III system for genome editing. Here, a method was developed to repurpose both CRISPR-Cas systems for genetic manipulation in Sulfolobus islandicus, a thermophilic archaeon. A novel type of genome-editing plasmid (pGE) was constructed, carrying an artificial mini-CRISPR array and a donor DNA containing a non-target sequence. Transformation of a pGE plasmid would yield two alternative fates to transformed cells: wild-type cells are to be targeted for chromosomal DNA degradation, leading to cell death, whereas those carrying the mutant gene would survive the cell killing and selectively retained as transformants. Using this strategy, different types of mutation were generated, including deletion, insertion and point mutations. We envision this method is readily applicable to different bacteria and archaea that carry an active CRISPR-Cas system of DNA interference provided the protospacer adjacent motif (PAM) of an uncharacterized PAM-dependent CRISPR-Cas system can be predicted by bioinformatic analysis.