自上而下蛋白质组学技术指南（一）

　　

——蛋白质谱技术指南，帮助研究人员应对自上而下蛋白质组学（top-down-proteomics）研究挑战

（以150µm 空间分辨率对一只大鼠的肾脏切面，进行多重质谱成像。每个颜色代表了一种多肽或蛋白的特殊质荷（m/z）比）

生物通报道：去年Albert Heck对商业购买的鸡卵清蛋白进行质谱仪分析，结果发现这种混合物比之前研究人员所认为的异质性要高一些，而且这一发现指出常用的分子量标记实际上至少有59个不同的蛋白质组形式（proteoforms，生物通译），每一种均带有其自身独一无二的翻译后修饰，这令他们感到十分惊讶。

“我们预期大约只有10-15种蛋白质组形式”，Heck说，“这一结果令我们感到惊讶”，Heck是乌得勒支大学生物分子质谱分析和蛋白质组学研究组主任。

Heck的这一发现从一个方面表明了自上而下蛋白质组学（top-down proteomics）研究的必要性。蛋白质组学的研究对象是生物体内所有的蛋白质，目标是发现它的组成和活动规律。

以生物质谱为基础的蛋白质组学分析方法主要有Bottom-up和Top-down两种方法，Top-down（自上而下）技术可以直接对完整的蛋白——包括翻译后修饰蛋白以及其它一些大片段蛋白测序，而非仅仅针对多肽；Bottom-up（自下而上）是传统的手段，它将蛋白质的大片段混合物消化/酶解成小片段的肽后再进行分析，是在蛋白质组学的研究中较为广泛使用的一种质谱技术。

经过多年的努力，研究人员通过自下而上的方法获得了上千种细胞蛋白，这些蛋白在细胞中发挥了各式各样的作用，组成了目前的一些蛋白质组学文库。但是由于自下而上的方法主要是消化蛋白，将得到的片段放入质谱仪中进行分析，然后将这些片段结果数据拼接在一起，因此生成的蛋白质草图都是失焦的混合物，从一片碎片中得到的平均结果。

而自上而下的方法则不同，这种方法采用的是完整的蛋白，直接进行质谱分析，捕获每个不同的蛋白质组形式独特的特性。

“分子分析应该由自上而下的方法完成，”西北大学分子生物科学和化学教授Neil Kelleher（他从事自上而下的蛋白质组学研究已经有二十年了）说。Kelleher估计有20,300个左右的人类基因组基因具有不同的翻译或翻译后修饰差异，构成了十亿个蛋白质组形式。

并且对于他来说，要深入探索这些蛋白的详细复杂性，唯一的方式就是通过自上而下的方法，解析完整蛋白质。

虽然Keller的系统性自上而下人类蛋白质组研究计划还未吸引很多人的注意，但是一些学术和行业研究人员越来越多地使用这种方法，进行蛋白研究，研发治疗性单克隆抗体，解析蛋白复合物，以及寻找生物标记物。这项技术也改变了病原体识别研究领域，帮助医生快速筛选合适的药物，治疗感染。甚至这种方法还可以用于鉴别细菌的抗生素抗药性菌株，将其与亲缘关系近的菌株区分开来。

“每年自上而下的蛋白质组学研究都能取得一小步进步，但这些进步汇集起来，就能影响越来越多的人，”Kelleher说。

新的质谱仪也朝着这一方向发展，之前的质谱仪需要耗资数百万美元，而且又笨重（基于磁铁），这给研究人员带来了资金和技术的许多障碍。目前有一些更加便宜、更小型、更方便用户使用的仪器已经推出市场，比如Orbitraps, quadrupole Time of Flight (QTOF),还有 matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI-TOF) ，这些都是能帮助研究人员通过自上而下方法进行研究。

The Scientist杂志介绍了几种利用现有质谱仪进行自上而下蛋白质组分析的方法。

Orbitraps

生物体内蛋白质种类繁多，性质复杂，数量庞大，动态范围广，因此，蛋白质样品在进入质谱前要进行预分离。常规的预分离技术有二维凝胶电泳、多维液相色谱、毛细管电泳等，另外还有一些针对特殊对象的分离方法，如去除高丰度的蛋白、对低丰度蛋白的富集分离。

一个成功的蛋白质组学实验必须兼顾样品制备、LC-MS/MS分离鉴定和数据处理的分析软件三方面，任何一方面不到位都可能导致实验的失败。赛默飞世尔在这方面做得比较齐全，有可蛋白质富集，细胞裂解、酶解，同位素标记等生物样品前处理；液相色谱、质谱，数据处理软件等一系列蛋白质组学产品。

其中LTQ Orbitrap系列是他们最高端的组合质谱仪。LTQ Orbitrap组合质谱仪将LTQ 与专利的获奖技术Orbitrap整合，在LTQ 灵敏、快速的基础上增加了轨道阱技术的高分辨率、高质量准确度的特点，具备了从复杂体系中快速、灵敏、可靠地检测化合物的能力。

LTQ 的所有分析性能及样品接口特点与Orbitrap宽广的动力学范围、卓越的灵敏度、高质量精确度和高分辨率等优点相得益彰。智能化、数据依赖的仪器控制确保了极大的分析灵活性，可方便根据不同分析问题灵活配置。在代谢物鉴定及“Bottom-up”蛋白质组学研究中，相应的数据采集及分析软件可将LTQ Orbitrap的强大分析性能转化成为精确、立即可用的数据信息。

合适的样品前处理和分离方法，再加上高性能的质谱和数据处理软件，这样就可以进行高通量的蛋白质发现与鉴定、蛋白质的相对定量以及翻译后修饰蛋白质组学研究。

Protein Discoverer 软件平台是一个综合性的、可拓展软件平台，可以对蛋白质组的数据进行定性和定量分析。取代了赛默飞世尔科技BioWorks™的Proteome Discoverer，是第一个商用的蛋白质组学数据分析平台，使研究者们可以在一个程序中，合并、比较和分析从多个来源来的数据。

Proteome Discoverer一个主要的优点是从多种裂解方法中分析信息的能力，从而去发现更多的翻译后修饰(PTMs)，并提高多肽和蛋白鉴定的准确度。蛋白质鉴定用的Protein Discover & Identification 是建立一个搜索树，可以灵活选择搜索方式，为不同的搜索建立不同的方式，建好之后统一提交进行搜索。

自上而下的蛋白质组学研究的关键点也在于质谱和软件，蛋白质分子量非常大，如何选择合适的质谱条件是这一技术的第一步。

在软件方面，赛默飞世尔有ProSightPC这个软件来支持Top-down的研究，ProSightPC可以在一个给定蛋白或肽段上鉴定一个未知质量的修饰，这个修饰可能是由于小段肽段的丢失，同源取代物，翻译后修饰，或由于样品前处理造成的人工缺陷，而且不需要预先知道是什么修饰。ProSightPC还可以很好地提高检测的通量。目前而止，对5万Da以内的蛋白质进行高通量的Top-Down已经较成熟。

（生物通：张迪）