华中科技大学Nature子刊发表荧光成像新技术

　　

生物通报道  来自华中科技大学的研究人员开发了一种新方法，证实可利用它来使得猝灭的荧光蛋白分子发生化学重激活，实现树脂包埋荧光微成像。研究结果发表在6月2日的《自然通讯》（Nature Communications）杂志上。

华中科技大学的曾绍群（Shaoqun Zeng）博士和龚辉（Hui Gong）教授是这篇论文的共同通讯作者。前者主要从事生物医学光学、生物医学成像、神经回路与蛋白质功能高分辨成像新技术新方法、生物信息技术等研究。后者的主要研究方向包括认知光学成像与神经信息学、数字生命与医学影像。

树脂包埋（Resin embedding）是一项开发成熟的方法，被广泛用作为电子显微镜和光学显微镜的基础工具。1949年，人们曾首次利用这一技术生成了用于透射电子显微镜检查的超薄切片。树脂包埋组织具有良好的切片特性，帮助研究人员克服了对厚组织进行显微镜检查面临的一些散射障碍。

近几十年来，绿色荧光蛋白（GFP）标记技术使荧光成像获得了革命性的突破。利用这一强大的分子生物学技术，将GFP附着到目的基因产物上以可见的方式标记出它们的表达，使得研究人员能够对其进行生物学功能和定位分析（延伸阅读：天津大学最新Nature子刊文章 ）。不幸的是，包埋过程中的脱水步骤及某些有机溶剂可导致水母GFP和其变异体,如广泛应用的EGFP和EYFP等发生猝灭，由此生成的弱荧光信号导致无法进行检测。这使得研究人员难于将树脂包埋方法与现代分子标记技术的优点结合起来。

多年来，研究人员一直试图通过优化包埋实验方案来改善树脂包埋程序中对于荧光的保护。尽管仍然存在猝灭情况，研究人员已成功地对一些用于相关显微镜研究的树脂包埋培养细胞及小组织进行了检测和分析，但这些方法难以用于处理厚组织块。目前研究人员对于树脂包埋程序的荧光猝灭机制仍然未知。此外，也不清楚是否可以成功保留标记结构。

以往的一些研究团队曾在水溶液中系统地研究过GFP的一些特性。也曾在酸性、碱性和变性剂溶液中探究GFP的行为。在这篇文章中，研究人员受到启发追踪了树脂包埋过程中GFP的行为。他们发现利用通常的包埋程序，大多数的GFP分子通过生色团质子化保持在一种非荧光状态，而未发生变性。在成像过程中利用他们称之为化学重激活（CR）的方法，可使这些GFP重新恢复荧光状态。相比于未处理样本，利用这种CR方法处理组织荧光强度增高了11.8倍。研究人员证实，这种CR方法能够可靠地保留树脂包埋组织中EYFP和EGFP的标记结构，实现对荧光标记组织块的荧光显微成像。

由于树脂包埋和荧光蛋白标记是生物和医学广泛应用的两种技术，作者表示他们的这种CR方法为两种从前不相兼容的重要方法提供了一个宝贵的桥梁，并有可能在未来推动其他的研究领域，促成新的研究突破。

（生物通：何嫱）

作者简介：

曾绍群

现任华中科技大学生物医学光子学与医学影像研究所所长、教授、博士生导师。兼任生命科学与技术学院教学指导委员会副主任、生物医学光子学教育部重点实验室副主任。曾先后赴美国宾夕法尼亚大学、美国耶鲁大学访问研究，并多次担任国际学术会议学术委员会成员。曾荣获华中科技大学青年教师创新奖、教育部高等学校优秀骨干教师等称号，并入选湖北省跨世纪学术带头人。

科研状况与主要学术成绩：
主持多项国家自然科学基金项目和863项目，包括863重点项目“生物信息的整合、模拟与可视化”，“数字化虚拟人体若干关键问题”子课题等。已经发表科研论文70余篇，其中SCI、EI收录40余篇，申请专利2项。

主要研究方向：1.数字生命与医学影像；2.认知光学成像与神经信息学；3.生物分子光子学

龚辉

华中科技大学生物医学光子学与医学影像研究所教授。现主持两项国家自然科学基金项目“用近红外光学成像技术研究前额叶在记忆中的作用”和“组织光学特性参数在体局部测量”，参加多项省部级以上项目研究，发表学术论文20余篇。

主要研究方向：1.认知光学成像与神经信息学；2.数字生命与医学影像。

生物通推荐原文摘要：

Chemical reactivation of quenched fluorescent protein molecules enables resin-embedded fluorescence microimaging

Resin embedding is a well-established technique to prepare biological specimens for microscopic imaging. However, it is not compatible with modern green-fluorescent protein (GFP) fluorescent-labelling technique because it significantly quenches the fluorescence of GFP and its variants. Previous empirical optimization efforts are good for thin tissue but not successful on macroscopic tissue blocks as the quenching mechanism remains uncertain. Here we show most of the quenched GFP molecules are structurally preserved and not denatured after routine embedding in resin, and can be chemically reactivated to a fluorescent state by alkaline buffer during imaging. We observe up to 98% preservation in yellow-fluorescent protein case, and improve the fluorescence intensity 11.8-fold compared with unprocessed samples. We demonstrate fluorescence microimaging of resin-embedded EGFP/EYFP-labelled tissue block without noticeable loss of labelled structures. This work provides a turning point for the imaging of fluorescent protein-labelled specimens after resin embedding.