定量Western blot中loading control的选择

随着荧光染料的发展，尤其是近红外荧光染料的出现，传统Western blot步入了定量研究的时代。在定量研究时代，比较研究更加需要稳定表达的内参蛋白，然而常用的loading controls，如肌动蛋白和微管蛋白，在病变组织与正常组织间、不同的正常组织间以及同一组织的不同部位都呈现出差异表达。于是，作者提出了用总蛋白分析（total protein analysis）进行标准化，并验证了它的灵敏度、线性及范围都优于常用的肌动蛋白和微管蛋白，更加满足定量Western blot研究的需求。

Western blot常用于确定生物样本中蛋白质的相对表达量。传统的化学发光法是一种定性或半定量的方法，因为累积发光量缺少线性和定量的重复性。随着荧光染料技术的进步，定量范围、灵敏度和稳定性都较ECL检测显著提高，Western blot检测也因此进入了定量分析的行列，而这对样品上样量一致性的控制提出了更高的要求。LI-COR公司是定量Western blot领域的领头羊，它的Odyssey双色红外激光成像系统具有*高的市场占有率，核心的近红外荧光染料具有定量准确、线性范围广、背景低、信噪比高以及双色检测等优势，作者利用这一系统开展了如下的研究。

为了精确测定样品中蛋白质的含量，研究者常设置loading controls （LCs）用作内参。常用的LCs蛋白源于广泛表达的“看家基因”，因为他们被认为在一系列样品中都有一致的表达水平，其中肌动蛋白（actin）和微管蛋白（tubulin）是*常用的两种LCs。但是，越来越多的研究指出这些蛋白质在动物和实验模型中差异表达。此外，LCs在不同组织间或不同处理间也存在差异。因此急需新的标准化方法确保定量Western blot结果的准确性。

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作者首先检索了已发表的芯片数据和质谱数据，发现常用的细胞骨架蛋白（actin，actinin和各种tubulin异构体）、线粒体蛋白（VDAC1和VDAC2）和细胞核蛋白（HC1）都存在差异表达。

接着作者用Odyssey的定量Western blot检测了脊髓性肌萎缩（Spinal muscular atrophy，SMA）小鼠的脊髓组织样本和正常样本中β肌动蛋白和β微管蛋白的表达水平。结果见图1，这两个蛋白的表达量在SMA小鼠中显著下降，分别为19.3±2%和7.3±0.5%。而这两个样本在总蛋白上的一致性却非常好，差异只有1.8±0.4%。

图1：β-肌动蛋白和β-微管蛋白的定量Western blot结果表明其在病理组织中的表达改变。A：β-肌动蛋白（42 kDa，绿色）和总蛋白（红色）的重叠图；B：β-微管蛋白（60 kDa，绿色）和总蛋白（红色）的重叠图；C：SMA小鼠和正常小鼠β-肌动蛋白和β-微管蛋白表达水平的变化，β-肌动蛋白（黑色），β-微管蛋白（灰色）。总蛋白（白色）用作对照。

证实了LCs在病变组织和正常组织间存在差异表达后，作者研究了LCs在不同正常组织间的差异表达。作者用Odyssey定量Western blot检测了C57Bl/6小鼠的肌肉、心脏、骨骼、颅骨，脾和脂肪组织中β-肌动蛋白的表达水平（图2 A和B）。为了确认这种变异不是由于上样量误差所引发，作者检测了不同分子量范围内的总蛋白（图2C）。结果表明这种差异非常小，上样的一致性非常好。不同组织间β-肌动蛋白的表达水平呈现出显著的差异（图2 B和D），尤其是心脏和肾脏间的差异尤为显著，达到44 arbitrary fluorescence units (AFU)。显然，用β-肌动蛋白去做数据均一化以及不同组织间的比较会导致巨大的偏差。

图2：β-肌动蛋白的表达水平在不同组织间高度变化。A：组织样本示意图，从左至右依次为：肌肉（腓肠肌），心脏，骨（股骨），颅骨，脾和脂肪组织（性腺）。比例尺=1厘米。B：Odyssey定量Western blot结果展示β-肌动蛋白（绿色）的表达水平在肌肉，心脏，骨骼，颅骨，脾和脂肪中高度变异。总蛋白染色（红色）叠加作为对照。C：不同分子量范围内的总蛋白量表明上样量控制的准确性。D.堆积条形图显示出β-肌动蛋白的相对变化（绿色）和总蛋白测定（红色）。

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另外，作者还发现在非对称组织的不同部位，LCs的表达水平也是不一致的。作者采用Odyssey定量Western blot研究了小鼠坐骨神经近端和远端β-肌动蛋白与neurofilament-light的表达水平，结果发现这两个蛋白质在不同区域的表达水平不一致（图3）。同样地，作者发现总蛋白具有很好的一致性。

图3：肌动蛋白和NF-L在小鼠坐骨神经的不同区域表达水平不同。

理想的内参需要具有宽的线性定量范围以满足不同丰度蛋白的定量需要。为了评估β-肌动蛋白和β-微管蛋白在定量Western blot上的适用性，作者检测了它们的工作线性范围和灵敏度。检测样本为梯度稀释的小鼠大脑组织匀浆液，总蛋白量为1-40 μg。结果发现β-肌动蛋白的线性范围为1-30 μg总蛋白量（图4 A和B）。这一定量Western blot的检测结果与先前报道的结果有差异，先前认为2 μg的总蛋白量β-肌动蛋白的信号就会达到饱和。这一差异在于先前研究采用的是低灵敏度的ECL检测，这一方法的定量能力不及Odyssey的近红外荧光检测技术。β-微管蛋白的的情况类似，只是其在大脑中的丰度更高，因此总蛋白量在8-10 μg时它的信号就达到了饱和（图4 A和B）。这一结果同样与先前的报道不一致，先前认为β-微管蛋白线性范围的上限为5 μg的总蛋白量。这一差异同样也是方法学上的差异所引起的。根据上述结果，β-微管蛋白更适于在检测低丰度蛋白时用作内参，而β-肌动蛋白具有更宽的线性范围。另外，相比传统的ECL法，LICOR公司的近红外荧光染料显然可以提供更加宽广的线性范围。

*后，作者提出了用总蛋白分析（total protein analysis）进行准确可靠的上样控制。作者用梯度稀释的胎牛血清白蛋白（BSA）标准品评估检测的灵敏度（图4 E和F）。荧光信号的线性非常好，R2达到0.998。另外，从图像可以看出，Odyssey近红外荧光法可以减少ECL法中常见的信号饱和问题。在实际应用中，总蛋白分析（考马斯亮蓝染色）具有比肌动蛋白和微管蛋白更宽的线性范围，1-40 μg，图4G和H。因此，以总蛋白分析做标准化能够很好地满足定量Western blot的需求。

图4：总蛋白分析具有比传统内参蛋白（肌动蛋白和微管蛋白）更好的灵敏度和更宽的线性范围。

原文：Total protein analysis as a reliable loading control for quantitative fluorescent Western blotting

欲了解近红外技术的其他应用，请参见“基于近红外荧光检测技术的In-Cell Western™ Assay的应用与方法学优势” http://www.ebiotrade.com/newsf/2012-10/2012101094727739.htm

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