NIBS叶克穷研究组发表CRISPR技术系统新发现

　　

2014年12月24日，北京生命科学研究所叶克穷实验室在《Nucleic Acids Research》发表题为“Cmr4 is the slicer in the RNA-targeting Cmr CRISPR complex”的论文，研究了III-B型CRISPR-Cas系统的Cmr复合体切割RNA的生化和结构机制。

CRISPR-Cas系统是在原核生物中广泛分布，具有自适应性并且能够遗传的免疫系统，由CRISPR DNA和cas基因组成。该系统的作用机制大致分为三个阶段。在适应阶段，宿主将外源噬菌体或质粒的DNA片端整合到自身基因组的CRISPR位点。在表达阶段，CRISPR位点进行转录，然后转录产物被加工为CRISPR RNA（crRNA）。

在干扰阶段，crRNA和Cas蛋白组成效应复合体，并利用crRNA序列互补的能力指导效应复合体识别并降解具有同源序列的DNA或RNA。Cmr复合体是III-B型CRISPR-Cas系统中的效应复合体，包含六种蛋白质亚基Cmr1-6和crRNA，此前的研究认为该复合体能够在单个特定位点切割与crRNA互补的底物RNA，切割位置由crRNA的3’端决定。

为了理解Cmr复合物的结构和功能，叶克穷实验室以前解析了Cmr2蛋白的晶体结构（FEBS Letter 2012）。在最新的研究中，作者通过生化实验发现，Pyrococcus furiosus Cmr复合物能够在间隔6 核苷酸的多个位点切割底物RNA，切割位置由crRNA的5’端决定，该结果修正了以往的结论。通过氨基酸定点突变，作者发现Cmr4是负责切割的催化亚基。作者还解析了Cmr4的晶体结构，发现Cmr4分子在晶体中头尾排列形成螺旋结构，该螺旋结构和最近解析的Cmr复合体电镜结构中的Cmr4的组织方式非常吻合。

另外，Cmr4螺旋内表面分布了几乎全部的保守暴露残基，具有成片的带正电区域，关键的催化残基Asp26也位于螺旋内表面，这些证据表明Cmr4螺旋内表面是结合crRNA和底物RNA的位点。该研究加深了对Cmr复合体的结构和它切割RNA分子机制的理解。

北京生命科学研究所已经毕业的博士生朱星为本文的第一作者，叶克穷博士为本文通讯作者。该研究由科技部、国家自然科学基金委员会、中科院、北京市政府等资助，在北京生命科学研究所完成。

原文摘要：

Cmr4 is the slicer in the RNA-targeting Cmr CRISPR complex

Clustered regularly interspaced short palindromic repeat (CRISPR) loci and CRISPR-associated (Cas) proteins form an adaptive immune system that protects prokaryotes against plasmids and viruses. The Cmr complex, a type III-B effector complex, uses the CRISPR RNA (crRNA) as a guide to target RNA. Here, we show that the Cmr complex of Pyrococcus furiosus cleaves RNA at multiple sites that are 6 nt apart and are positioned relative to the 5′-end of the crRNA. We identified Cmr4 as the slicer and determined its crystal structure at 2.8 Å resolution. In the crystal, Cmr4 forms a helical filament that most likely reflects its structural organization in the Cmr complex. The putative active site is located at the inner surface of the filament where the guide and substrate RNA are thought to bind. The filament structure of Cmr4 accounts for multiple periodic cleavage sites on the substrate. Our study provides new insights into the structure and mechanism of the RNA-targeting Cmr complex.