清华大学Cell子刊发表CRISPR新文章

　　

生物通报道  来自清华大学、哈佛医学院和斯坦福大学等机构的研究人员，通过优化sgRNA的参数提高了CRISPR/Cas9系统在果蝇中的特异性和效率。研究结果发布在10月23日的《Cell Reports》杂志上。

清华大学医学院的倪建泉（Jian-Quan Ni）博士和斯坦福大学的Jin Billy Li教授是这篇论文的共同通讯作者。倪建泉的主要研究方向包括干细胞增殖与分化机制、细胞信号的调控与协同、细胞信号与表观遗传学，以及分子和遗传工具的研发。

在过去的几年里，人们见证了序列特异性的DNA 核酸内切酶技术的惊人发展，其能够在模式生物中实现精确的基因组编辑，为大大提高我们对于发育生物学和疾病的理解带来了希望（延伸阅读：Nature：CRISPR技术在癌症领域大放异彩 ）。就成本、设计和效率各方面而言，CRISPR/Cas9系统相比于锌指核酸酶(ZFN)和转录激活因子样效应物核酸酶(TALENs)都具有很多的优势。但尽管强大的CRISPR/Cas9系统有着广泛的用途，它的特异性和效率仍是用户群共同关心的两个问题。

一些哺乳动物细胞研究表明，单导向RNA (single-guide RNA,sgRNA)和基因组DNA之间核苷酸错配的数量、位置和分布是影响脱靶效应和诱变效率的主要参数。还有研究证实Cas9和sgRNA的表达水平共同影响了诱变效率和脱靶效应。但大多数的细胞系研究都没有独立评估Cas9和sgRNA，一项体内研究表明在某一Cas9表达范围内sgRNA参数是影响特异性和效率的主要因素。

近期，国内外的医学研究人员开发出了用于果蝇的CRISPR/Cas9系统。但还没有系统研究评估CRISPR/Cas9系统的效率和特异性。人们迫切期望能够对影响CRISPR/Cas9系统在果蝇中特异性和效率的参数展开系统性的调查。

在这篇文章中研究人员发现，脱靶效应并不存在于与sgRNAs有三个或更多核苷酸错配的基因组DNA区域。重要的是，他们证实了诱变效率与sgRNA的6个前间区序列邻近基序近端核苷酸（protospacer-adjacent motif-proximal nucleotides, PAMPNs）的GC含量之间呈强正相关。

此外，研究人员证实通过按照他们确定的优化浓度注入精心设计的sgRNA质粒，可以在一个步骤中有效生成4个基因的突变。最终，利用优化的参数他们通过同源介导的修复(Homology-directed repair, HDR)生成了HP1a的无效等位基因，并获得了相比以前报告的要显著高得多的总诱变率。

新研究工作证实了综合优化sgRNA有望大大简化在果蝇中的CRISPR/Cas9实验。

（生物通：何嫱）

作者简介：

倪建泉

2010年10月－现在，清华大学医学院PI，博导
2009年1月－2010年9月，博后，哈佛大学医学院遗传系，霍华德休斯医学研究所，Norbert Perrimon 实验室，波士顿，美国
2007年1月－2008年12月，助理，JFRC，霍华德休斯医学研究所，Gerry Rubin and Norbert Perrimon 实验室，华盛顿，美国
2006年5月－2006年12月，博后，哈佛大学医学院遗传系，霍华德休斯医学研究所，Norbert Perrimon 实验室，波士顿，美国
2001年10月－2006年4月，博士，FMI，巴塞尔大学，Fang-Lin Sun 实验室，巴塞尔，瑞士

研究兴趣：干细胞与表观遗传学

研究方向：1.干细胞增殖与分化机制；2.细胞信号的调控与协同；3.细胞信号与表观遗传学；4.分子和遗传工具的研发

生物通推荐原文摘要：

Enhanced Specificity and Efficiency of the CRISPR/Cas9 System with Optimized sgRNA Parameters in Drosophila

The CRISPR/Cas9 system has recently emerged as a powerful tool for functional genomic studies in Drosophila melanogaster. However, single-guide RNA (sgRNA) parameters affecting the specificity and efficiency of the system in flies are still not clear. Here, we found that off-target effects did not occur in regions of genomic DNA with three or more nucleotide mismatches to sgRNAs. Importantly, we document for a strong positive correlation between mutagenesis efficiency and sgRNA GC content of the six protospacer-adjacent motif-proximal nucleotides (PAMPNs). Furthermore, by injecting well-designed sgRNA plasmids at the optimal concentration we determined, we could efficiently generate mutations in four genes in one step. Finally, we generated null alleles of HP1a using optimized parameters through homology-directed repair and achieved an overall mutagenesis rate significantly higher than previously reported. Our work demonstrates a comprehensive optimization of sgRNA and promises to vastly simplify CRISPR/Cas9 experiments in Drosophila.