新技术准确定量罕见的mtDNA缺失

　　

生物通报道 Fred Hutchinson癌症研究中心的研究人员近日发现了一种新工具，能够准确分析与多种疾病和衰老相关的极罕见线粒体DNA缺失。这项成果在线发表于《Aging Cell》杂志上。

mtDNA突变的积累与衰老、神经肌肉疾病和癌症有着密切的关联。然而，目前的方法无法准确定量和鉴定新的缺失事件，因其发生频率非常低，正常组织中每1亿个线粒体基因组约有一个缺失事件。为了解决这些限制，研究人员开发出一种基于ddPCR的分析方法，来高分辨率地分析这些罕见缺失。他们将这种方法称为“数字缺失检测（Digital Deletion Detection）”，简称3D。

文章的通讯作者Jason Bielas博士谈道：“研究mtDNA突变是极其困难的，更不用说缺失。我们的3D检测在特异性、灵敏度和准确性上与传统方法相比有了明显的改善。微滴式数字PCR所带来的通量增加让分析时间从数月缩短至数天。若没有这一技术，我们无法获得这一发现。”

Bielas博士指的是Bio-Rad的QX100™ ddPCR系统。利用这一系统，研究小组分析了80亿个人类脑mtDNA基因组，并鉴定出超过10万个带有缺失的基因组。他们发现，与流行的看法相反，大多数mtDNA缺失的增加并不是由新的缺失引起的，而是之前缺失的扩增。他们推测，现有突变的扩增应当是造成mtDNA缺失积累的主要因素。

3D是一个新颖的三步法过程，包括富集带有缺失的分子；基因组被分成单分子液滴，并通过ddPCR定量；利用新一代测序确定断裂点。

富集完成后，通过QX100系统调整液滴中的分子浓度，让大多数液滴不含有突变基因组，而少数只有一个。这一过程允许每个缺失被无偏向地放大，而不会像qPCR那样引入误差。

在扩增后，Bielas及他的小组利用ddPCR确定突变分子的绝对浓度。根据液滴荧光和扩增子大小之间的关系，他们能够鉴定大脑样品中罕见缺失的大小和复杂性（到底是几个克隆的扩增，还是大量随机缺失）。

研究人员认为，3D检测作为一种重要的新工具，将有助于更好地研究缺失形成和扩增的机制，以及它们在衰老中的作用。而微滴式数字PCR的高通量和高灵敏度也让Bielas博士的实验室能够靶定骨骼肌、脑组织和血液中其他低水平的致病mtDNA缺失。（生物通 余亮）

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Targeted Enrichment and High-Resolution Digital Profiling of Mitochondrial DNA Deletions in Human Brain

DOI: 10.1111/acel.12146