BioTechniques：快速可靠提取mtDNA的新方法

　　

生物通报道  阿尔伯特•爱因斯坦医学院的研究人员开发出一种快速可靠的方法，能从真核细胞中提取出线粒体DNA（mtDNA），直接用于新一代测序，从而避免了传统方法的扩增偏向。这项成果发表在《BioTechniques》杂志9月刊上。

在哺乳动物细胞中，线粒体常常以几千个拷贝存在。线粒体基因组缺乏组蛋白保护，且靠近活性氧簇。这些因素，再加上mtDNA复制和修复机制的保真性有限，使得线粒体基因组的突变率比核基因组高，带来了mtDNA的异质性。不过，mtDNA随机突变的有害影响可通过多个线粒体的存在而补偿。这种较低的选择压力让突变的mtDNA随时间积累，也让mtDNA成为各种破坏因素不利影响的指示剂。

目前，新一代测序（NGS）已广泛用于mtDNA的分析。然而，尽管每个细胞中存在多个线粒体基因组，但mtDNA只占细胞总DNA的一小部分，这也让mtDNA的富集成为必需。但目前的富集方法要么需要特殊的设备（超速离心机），要么需要购买昂贵的试剂盒，或者通过PCR扩增mtDNA。最后这种方法因相对经济高效而最为常用，但难免引入扩增偏向。

为了克服这些限制，研究人员设计了一种快速可靠的方法，从哺乳动物细胞中分离mtDNA，直接用于新一代测序。整个过程分为两步：(1) 利用标准的质粒小提试剂盒（QIAGEN Miniprep Kit）提取出富含mtDNA的片段，(2) 利用Agencourt AMPure XP系统（贝克曼库尔特）进一步纯化mtDNA。这种方法能够让mtDNA得到~2000倍的富集，比商业化的试剂盒更好，且成本更低。

（图片来自BioTechniques）

之后，研究人员应用这种方法从小鼠胚胎成纤维细胞中分离mtDNA，并将结果与两种商业化的试剂盒进行比较。定量PCR的结果表明，他们的方法实现了mtDNA的>1000倍富集，而其他试剂盒只有10倍富集。且第二步的磁珠纯化只有在应用于QIAGEN试剂盒提取出的DNA样品时才有效。有趣的是，即使没有磁珠纯化，QIAGEN质粒小提试剂盒的结果也比商业化的试剂盒好得多。

研究人员还对纯化出的mtDNA进行了10个循环的扩增，并在文库制备后，用于Ion Torrent PGM系统的测序。结果表明，在10个循环的扩增后，99%的reads定位到线粒体基因组，而在未扩增的样品中，也有22%的reads定位到线粒体基因组。

作者认为，这些结果表明，他们的新方法是制备mtDNA用于新一代测序的经济快速的方法。即使不扩增，也能实现mtDNA的序列分析。（生物通 薄荷）

原文检索

Fast mitochondrial DNA isolation from mammalian cells for next-generation sequencing

BioTechniques, Vol. 55, No. 3, September 2013, pp. 133–136