《Cell》发表创新性蛋白质研究技术

　　

生物通报道  就像一台小型的、运转良好的机器，酶是由多个相互连锁的分子元件构成的一类蛋白质，在每个细胞中执行着各种各样的任务。然而，这些元件是如何精确协同作用来完成任务的？这一问题长期困扰着科学家们。现在，一个研究人员小组发现了一种绘制酶潜在分子机器图谱的新方法，根据它揭示的模式，研究人员能够预测一种酶的行为方式，以及当这一过程遭受破坏时会发生的事件。

在8月8日的《细胞》（Cell）杂志上，由Gladstone研究所和加州大学旧金山分校研究员Nevan Krogan博士，德州A&M大学的Craig Kaplan博士和加州大学旧金山分校教授Christine Guthrie领导的一个科学家小组，描述了一种称作为pE-MAP（point mutant E-MAP）的新技术，借助于它研究人员能够精确找到并绘制出一种酶内许多移动部件彼此之间成千上万的相互作用。

研究人员将焦点放在了众所周知的RNA聚合酶II (RNAPII)上，并利用了单细胞酿酒酵母（S. cerevisiae）作为模型。研究人员以往曾绘制出RNAPII的物理结构，然而却不清楚酶内的各部分是如何与细胞内其他蛋白质一同发挥作用，完成重要功能的。

Kaplan博士说：“科学家们知道RNAPII的物理结构，但这一大型酶具有许多不同的区域，每个区域执行着不同的功能。我们想将这些区域和功能之间的点连接起来。”

研究小组采用了一种遗传学方法，生成了53个RNAPII“突变体”，每个都改变了RNAPII的一个特定元件。他们想测试出每个突变对应的特定功能。通过这种方式，他们就能够将酶的特定区域与一种特异功能联系起来。

但是这样做，他们不得不将每个突变体与细胞内RNAPII相关的数千功能进行比较，这是采用传统方法无法完成的一个巨大的任务。因此，研究小组开发了这种pE-MAP方法。

Krogan 博士说：“并非是将单个点突变与一个或两个不同的突变体进行交叉比较，pE-MAP使得我们能够交叉比较单个点突变与超过1000个突变体。这为我们提供了每个突变体1000个数据点，随后我们利用这些数据点构建出了高分辨率的图谱。”

论文的主要作者、Krogan 实验室研究生Hannes Braberg 说：“直到现在，要获得类似的信息唯一的方法就是，灭活或‘敲除’酶内的特定基因，观察其影响。而RNAPII是如此的至关重要，哪怕灭活一个基因往往也会杀死细胞。因此没有敲除这些基因，我们转而让它们发生了突变。”

研究人员随后将新生成的图谱，与每个RNAPII突变体如何能够将DNA转录为RNA这一RNAPII最重要的功能关联起来。研究小组发现，一些RNAPII突变体的转录速度慢于其他的突变体，而另一些则更快。进一步的分析揭示，慢转录者彼此之间有一些重要的相似之处，快转录者也是如此。这种模式使得研究人员能够预测每个突变体的转录速度。

随后，研究小组还发现了与转录相关另一种现象，其涉及到剪接过程。剪接就是指将特异的非编码RNA片段切除，将剩余的片段连接在一起的过程。从前，科学家们推测，转录速度与剪接相关——快转录者是不太精确的剪接者，反之亦然。但是没人能够看到它的行为。因此Guthrie博士利用pE-MAP方法生成的图谱，实时观察了转录速度对于剪接精确度的不同影响。

Guthrie 说：“当转录速度减慢之时，剪接更有效率。我们看到了快转录者的反向效应——这一长期以来预测存在，却从未观察到得到现象。这再度证明了pE-MAP方法的效力。”

研究人员称，这种方法还可以用于研究其他的酶。并且研究人员还可以将了解到的知识应用于了解像RNAPII这样的蛋白质发生突变导致特定的疾病状态的机制，并最终可能赋予我们纠正这些疾病的能力。

（生物通：何嫱）

生物通推荐原文摘要：

From Structure to Systems: High-Resolution, Quantitative Genetic Analysis of RNA Polymerase II

RNA polymerase II (RNAPII) lies at the core of dynamic control of gene expression. Using 53 RNAPII point mutants, we generated a point mutant epistatic miniarray profile (pE-MAP) comprising 60,000 quantitative genetic interactions in Saccharomyces cerevisiae. This analysis enabled functional assignment of RNAPII subdomains and uncovered connections between individual regions and other protein complexes. Using splicing microarrays and mutants that alter elongation rates in vitro, we found an inverse relationship between RNAPII speed and in vivo splicing efficiency. Furthermore, the pE-MAP classified fast and slow mutants that favor upstream and downstream start site selection, respectively. The striking coordination of polymerization rate with transcription initiation and splicing suggests that transcription rate is tuned to regulate multiple gene expression steps. The pE-MAP approach provides a powerful strategy to understand other multifunctional machines at amino acid resolution.