北京基因组研究所最新文章比较高通量筛选方法

　　

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生物通报道：P2X7受体是嘌呤-配体门控离子通道受体家族 P2X的一员，是神经退行性疾病、类风湿关节炎、神经性疼痛药物筛选的重要靶标, 已成为大型制药公司新的研究热点。近期中国科学院北京基因组研究所的研究人员针对3 种用于检测 P2X7受体高表达细胞系药理学特征的高通量荧光检测方法，进行了比对，指出更适用于 P2X7受体调节剂的低成本、高通量药物筛选方法。

P2X7 受体属于配体门控通道 P2X 受体家族, 属胞外核苷酸受体, 是继烟碱受体家族和谷氨酸受体家族后第 3 类配体门控离子通道, 配体是 ATP (adenosine-5′-triphosphate)。迄今为止已经从哺乳动物细胞中克隆了 7 个 P2X 亚单位, 按照分布、 离子通透特性及对 ATP 的亲和力不同, 命名为 P2X1~7 受体. P2X7 受体主要在上皮细胞和免疫系统细胞中表达, 如淋巴细胞、肥大细胞和巨噬细胞, 参与免疫调节的过程, 如炎性细胞因子释放、膜融合及细胞凋亡。

近年的研究表明, 改良后的 P2X7 受体拮抗剂AZD9056 已进入治疗类风湿关节炎的二期临床实验, A-740003 在神经性疼痛的啮齿类动物模型 上表现出良好的药效。P2X7 受体可能是治疗各种 神经退行性疾病、类风湿关节炎和神经性疼痛的靶标。

目前针对 P2X7 受体药理学特性的研究手段十分有限。P2X7 受体在天然配体 ATP或特异配体 Bz-ATP (3′-O-(4-benzoyl)-benzoyl adenosine-5′-triphosphate) 的短时间刺激下, 形成非选择性阳离子通道, 从而介导细胞对钠离子、 钾离子和钙离子等的通透性, 并导致细胞膜去极化。离子内流和膜电位的变化都可用于建立 P2X7 受体的筛选检测方法。

在这篇文章中，研究人员构建表达人源 P2X7 受体(hP2X7R)的人胚肾细胞系 HEK-293, 利用荧光成像分析系统(FlexStation), 针对 P2X7 受体特性, 比较和验证了 3 种用于检测 P2X7受体高表达细胞系药理学特征的高通量荧光检测方法, 分别是膜电位检测法、溴化乙啶内吞检测法和钙内流检测法。

通过比较 3 种不同的方法, 研究人员选定简便快捷的钙内流检测法。通过验证, 该模型稳定、灵敏, 适用于高通量筛选 P2X7 受体调节剂, 为体外研究 P2X7 受体生理病理功能, 继而开发相关先导药物奠定了基础。

研究人员表示，所使用的多种检测方法都能有效地测定人 P2X7受体的功能, 但是每种方法各有优缺点。全细胞膜片钳法虽然是黄金标准, 但是这种方法要求有专业的操作人员, 实验通量低, 成本昂贵, 并不适应高通量药物筛选的要求。

3 种不同的荧光检测方法实验通量高, 可以实现96孔板甚至384孔板的实验通量, 相对 来说成本低, 可以用于高通量药物筛选。但是膜电位检测法信噪比低, 信号窗口小, 而且 HEK-293 母细胞有一定量的背景值; 溴化乙啶内吞检测法实验步骤繁琐, 需要多次清洗细胞孔板, 这都大大影响到了这 2 种方法的大规模筛选可操作性。相比较而言, 钙内流检测方法有着 10 倍的信号窗口, 信噪比高, 而且使用了可以免洗的钙敏感荧光染料, 更适合进行P2X7 受体调节剂的高通量筛选。

原文检索：

蒋亚琴, 尹琪, 栗世铀. 以 P2X7 受体为靶标的高通量筛选方法. 科学通报, 2013, 58: 1739–1747
Jiang Y Q, Yin Q, Li S Y. Cellular fluorescent high-throughput screening assays of the ATP-gated P2X7 receptor. Chin Sci Bull, 2013, 58, doi: 10.1007/s11434-013-5870-7