#微孔板秘笈5#荧光偏振法检测牛布鲁氏菌和牛分枝杆菌[创新技巧]

--Diachemix 公司特异型抗体检测试剂盒

生物通联合BioTek在2013年重磅推出#微孔板秘笈#，为您介绍微孔板相关检测产品的应用。4月份我们将聚焦微生物检测。本文介绍了Diachemix公司的新型抗体检测试剂盒，采用BioTek 公司多功能微孔板检测仪Synergy2 的荧光偏振功能来检测牛布鲁氏菌和牛分枝杆菌。

Paul Held Ph. D., Senior Scientist, Applications Dept., BioTek Instruments, Inc.
Michael E. Jolley Ph. D., Diachemix Corporation

牛布鲁氏菌和牛分枝杆菌是导致牛布鲁氏菌病和肺结核的主要病原菌。这些病菌同样也严重威胁公共卫生健康，并在全世界范围内导致了巨大的经济损失。本文介绍了Diachemix公司的新型抗体检测试剂盒，采用BioTek 公司多功能微孔板检测仪Synergy2™ 的荧光偏振功能来检测牛布鲁氏菌和牛分枝杆菌。

介绍

家畜间接触性传染，严重威胁到家畜的健康，同时会导致巨大的经济损失。布鲁氏菌感染性疾病在反刍动物中具有极大的传染性并导致受到感染动物的流产或者早产。牛分枝杆菌是一种生长缓慢的厌氧菌，它是导致牛肺结核的主要致病菌。这些病菌同时还能够感染其他一些动物，甚至包括人类。在牛血清中检测这些病原菌抗体的存在可以提示这些病原菌的感染。

荧光偏振是一种特殊的荧光检测技术，该技术早在1926 年就由Perrin 第一次说明了。这项技术主要基于荧光基团在被偏振光激发后会发出偏振光的原理。在溶液中，发出的偏振光的强度与荧光分子的转动速度成反比，而荧光分子的转动速度受到反应溶液的粘稠度，绝对温度，分子大小和气体常数影响。如果保持液体粘性和温度恒定，那么分子的转动速度就只与分子大小或者分子重量相关。

荧光偏振检测采用水平和垂直两个偏振滤光片来把激发光源变成偏振光。荧光分子的偏振值与分子的转动速度成反比。由于分子转动速度同时与分子大小成反比，在分子复合物变大时荧光偏振值也变大，在分子复合物变小时荧光偏振值也变小。发射的荧光强度通过水平偏振片和垂直偏振片后进行检测。水平偏振光转变为垂直偏振光的程度与荧光分子的转动速度成正比。如果一个 荧光分子比较大，在激发过程中分子的移动非常慢，这样水平偏振光转变为垂直偏振光的强度就很小。然而，如果荧光分子很小，转动速度非常快，就会导致较大的水平偏振光转变为垂直偏振光。

实验原理

使用O- 多聚糖（OPS）偶联一个荧光素来检测布鲁氏菌特异性的抗体。脂多糖是细菌细胞壁的主要组成部分，也是宿主抗体的抗原决定簇。OPS- 荧光素分子相对比较小，可以在溶液中自由移动。这样分子的荧光偏振值就比较小。如果溶液中含有OPS 特异性抗体，那么抗体就会和OPS 结合使分子复合物变大，这样会导致荧光偏振值增大。牛分枝杆菌特异性抗原也采用类似的方式检测。检测牛分枝杆菌采用荧光标记一个与细菌MPB70 蛋白表位类似的多肽。当这个表位特异性的抗体与荧光标记多肽结合时，荧光偏振性就增强（图1）。

图1. 抗体示踪法结合牛分枝杆菌抗体测试。

材料和方法

牛分枝杆菌和布鲁氏菌FPA 抗体检测试剂盒购于Diachemix公司(Milwaukee，WI)。试剂盒中的阳性对照和阴性对照按照试剂盒说明进行实验。牛分枝杆菌抗体检测实验时，加100μL 反应缓冲液到每个反应孔中，再加100μL 阳性对照或者缓冲液（阴性对照）到反应孔中，混匀，要注意不能产生气泡。反应板在室温下孵育30 分钟，然后加入10μL 偶联液，并彻底混匀。孵育10 分钟后检测荧光偏振值。采用类似的方法检测布鲁氏菌抗体。简单步骤如下：20μL 样品倍比稀释液和对照加到反应板中，再加入180μL 缓冲液。孵育5-60 分钟后，每孔加入10μL 偶联液，然后室温孵育2-60 分钟，最后检测偏振值。

样品偏振值使用Synergy2 多功能微孔板检测仪（BioTek，Winooski VT）检测，仪器装配有荧光偏振（FP）和时间分辨荧光（TRF）模块。水平偏振和垂直偏振荧光值通过485/20 激发滤光片和528/25 检测滤光片以及510nm 二向色镜检测。根据Diachemix 的说明，使用氙闪灯（时间分辨荧光模块）。PMT 检测器的灵敏度值设定为让水平偏振值在30000 RFU 左右。仪器和偏振值的计算都是由Gen5软件控制和自动计算，其中，G 因子设定为0.85。

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结果

使用布鲁氏菌家畜试剂盒检测时，阴性对照和阳性对照的偏振值，以及只加OPS- 荧光示踪剂的偏振值通过微孔板检测仪进行检测和计算。在图2 中显示，阳性对照的平均值为222.8mP，而示踪剂和阴性对照的平均值分别为86.1mP 和89.2mP。阳性样品，就如阳性对照一样，其荧光偏振值比阴性对照值有明显增加。一个样品的偏振值如果比阴性对照大20mP，既可认为样品为阳性样品。

图2. 比较布鲁氏菌阳性对照和阴性对照荧光偏振值。

使用牛分枝杆菌试剂盒检测示踪剂和阳性对照样品的偏振值见图3。在这个实验中， 阳性对照的偏振平均值为137.8mP，而示踪剂的偏振平均值为72.4mP。使用这个试剂盒时，样品的偏振值比阴性对照大15mP 时，既认为样品为阳性样品。

图3. 牛分枝杆菌的阳性对照和阴性对照偏振值对比。

讨论

以上这些数据显示，使用Diachemix 荧光偏振试剂盒配合Synergy2 多功能微孔板检测仪可以作为家畜感染检测的完美平台。在使用Synergy2 多功能微孔板检测仪进行荧光偏振检测时，实验快速，操作简单。虽然这里仅仅介绍了两个检测试剂盒，Diachemix 公司提供了多种荧光偏振试剂盒，这些试剂盒实验都可以在Synergy2 多功微孔板检测仪上检测。荧光偏振技术提供了一种快速简单的检测方法。其均相的检测模式不需要洗涤步骤，这样提高了检测的速度，同时也避免了其它洗板机等设备的购买。该实验操作简单，需要试剂量少，而检测结果更准确，而且比其他常规方法检测具有更高的灵敏度。

示踪剂的荧光偏振值大约在75-80mP，对于每一种偶联剂，没有结合的荧光偏振值约为20mP 左右。这些变化反应了荧光分子本身偏振值与加入抗原表位OPS 或者布鲁氏菌或牛分枝杆菌多肽后荧光偏振值的改变。最重要的是实验有效检测范围，这反应了未结合示踪分子和完全结合分子荧光偏振值的差异。这种差异涉及相对改变而不是分子结合后大小的绝对改变。总之，如果示踪分子本身比较大，结合后荧光偏振值改变就比较小。同样的，如果结合了一个很小的分子，那么荧光偏振值改变也会很小。布鲁氏菌和牛分枝杆菌抗体检测试剂盒的设计是重复考虑上述因素，保证荧光偏振有明显改变。较大的检测范围保证抗体量非常微小时的检测灵敏度。

布鲁氏菌检测试剂盒已经得到了多个组织的认证，可以检测家畜的感染。美国USDA 批准这个试剂盒可用于筛查和确认牛，野牛，猪的感染。国际动物卫生组织（OIE）也批准用于检测牛和小的反刍动物。另外，该试剂盒即将通过欧洲EFSA的认证，以用于检测牛和小反刍动物的感染。

在加拿大，美国，南非，希腊等一些国家，正在进行牛分枝杆菌检测试剂盒的论证。

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参考文献
1. Perrin, F. (1926) Polarization de la Lumiere de Fluorescence. Vie Moyenne de Molecules dans L’etat Excite. J. Phys Radium 7:390.
2. Nasir MS, Jolley ME (1999). Fluorescence polarization: ananalytical tool for immunoassay and drug discovery. Comb. Chem. High Throughput Screen. 2(4), 177-90. Review.
3. Jolley ME, Nasir MS, (2003) The use of fl uorescence polarization assays for the detection of infectious diseases Comb. Chem. High Throughput Screen 6(3):235-44.
4. Nielsen K, Lin M, Gall D, Jolley M (2000) Fluorescence polarization immunoassay: detection of antibody to Brucella abortus Methods, Sep;22(1):71-6.
5. Lin M, Sugden EA, Jolley ME, Stilwell K. (1996) Modification of the Mycobacterium bovis extracellular protein MPB70 with fl uorescein for rapid detection of specific serum antibodies by fl uorescence polarization. Clin Diagn Lab Immunol. Jul;3(4):438-43.
6. Jolley ME, Nasir MS, Suruballi OP, Romanowska A, Renteria TB, De la Mora A, Lim A, Bolin SR, Michel AL, Kostovic M, Corrigan EC (2007) Fluorescence polarization assay for the detection of antibodies to Mycobacterium bovis in bovine sera. Vet. Microbiol.120:113-121.