AlphaLISA筛选技术在SpectraMax Paradigm多功能检测平台上的应用[创新技巧]

      炎症：身体对感染、刺激或者其他伤害的反应。它通常伴随着内皮趋化因子的增加和粘附分子的表达。这可能导致广泛的中性白细胞浸润。新型抗炎化合物的研究能够下调这些因子的表达，减少组织损伤，具有广阔的治疗前景。但是，我们需要一种快速和高灵敏的平台对这些治疗性抗炎化合物进行筛选，对导致炎症的因子进行定量。

      Molecular Devices公司的SpectraMax® Paradigm®多功能检测平台是市场上唯一一个用户可升级的微孔板检测平台，使用户可以在不到两分钟内对系统进行实时功能配置。如果需要使用Alpha技术，用户可以在任何时候自己升级。SpectraMax Paradigm平台能够快速对TNF-alpha因子进行定量，通过对TNF-alpha刺激的人内皮细胞中细胞因子的定量实现抗炎代谢产物的高灵敏筛选。

  
      AlphaLISA®是一种基于微珠的均相检测技术，用于在微孔板中研究分子之间的相互作用。可以用于细胞因子的定量以及筛选具有抗炎活性的化合物。和传统的ELISA方法相比，ELISA需要多次洗涤步骤，而洗涤操作可能破坏贴壁的细胞。AlphaLISA无需洗涤，减少细胞损失，使实验结果SD值更小，数据更加准确。

TNF-alpha纯化和定量

      首先，需要获得纯化的TNF-alpha蛋白，用于刺激内皮细胞产生炎症反应。为此目的，人TNF-alpha因子在Pichia pastoris酵母中进行表达。使用酵母的好处是既可以表达大量的重组蛋白又不会产生干扰细胞水平实验的内毒素。我们可以从每升酵母培养物中纯化获得10-20mg具有生物活性的蛋白。SpectraMax Paradigm平台使用AlphaLISA方法可以定量低至pmol级的蛋白（图1）。使用软件内置的经过优化的检测程序，可以在2分钟内完成384孔板的检测。

 

TNF标准曲线（图1）

SpectraMax Paradigm平台的TNF-alpha定量可以低至pmol水平，检测范围可以达到4个数量级。

 

促炎症因子检测

      然后，我们开发出一个AlphaLISA分析方法，用于检测内皮细胞经过TNF-alpha刺激后产生的促炎症因子的水平。使用上面纯化的人重组TNF-alpha蛋白处理人肺微血管内皮细胞（HLMVEC）诱导细胞间粘附因子1（ICAM-1）表达。在孵育处理18小时后ICAM-1被上调表达。使用AlphaLISA对ICAM-1的表达水平进行定量（图2A）。

      内皮细胞经过TNF-alpha或LPS刺激后，表达分泌IL-8。IL-8是一种中性白细胞的趋化蛋白，而中性白细胞可以在体内浸润发炎的组织。因此，对内皮细胞分泌的IL-8进行定量，可以提供很有价值的在体外血管内皮细胞促炎症反应状态信息。为了评估分泌的IL-8水平，我们使用AlphaLISA分析了经过处理的HL-MVEC细胞培养上清样品（图2B）。

ICAM-1和IL-8在HL-MVEC内表达上调（图2）

TNF–alpha处理细胞18小时后，使用SpectraMax Paradigm平台的AlphaLISA方法检测 HL-MVEC细胞内ICAM-1 (A) 和IL-8 (B) 的上调水平。

基于内皮细胞筛选鉴定抗炎化合物

      蓝藻是一种蓝绿色藻类，它具有非常多样的代谢产物。其中一些代谢产物具有很好的治疗前景，目前正在研究用于治疗炎症疾病。1,2,3我们使用上面描述的方法从蓝藻中筛选具有抗炎症的化合物。HL-MVEC预先使用从Nostoc蓝藻中提取的不同组分进行处理，然后使用0.4ng的人TNF-alpha蛋白进行刺激。18个小时后，在SpectraMax Paradigm平台上使用AlphaLISA技术检测得到ICAM-1得以上调表达，然后对细胞培养上清进行进一步分析IL-8的水平。我们发现蓝藻8721,6组分（图3）可以显著降低ICAM-1的产生，显示出抗炎症活性。这个组分也明显降低IL-8的表达分泌（数据未给出）。在进行AlphaLISA检测前，也对组分进行了细胞毒性检测，显示其细胞毒性作用很小，可以忽略。

蓝藻中抗炎活性成分的筛选（图3）

使用AlphaLISA分析蓝藻中各组分的ICAM-1上调效应。组分8721,6可以显著降低ICAM-1的表达生成。

总结

SpectraMax Paradigm平台联合AlphaLISA提供了一个强有力的工具，可以使用基于内皮细胞、病理相关的模型筛选新型的治疗药物。高灵敏度、高速度、高达1536孔板的兼容性以及内置的预先优化的检测程序，使用户操作更简单、运行更快速。SpectraMax Paradigm是你使用Alpha技术筛选药物的最好选择。

我想了解SpectraMax Paradigm多功能检测平台的更多信息

致谢

最后我们要感谢Maren Plüger Anita Eigner、Maria Hirschler、Linda Kotnik、Katrin Fuchslueger、Julia Schweiger、Christoph Wiesner、Andreas Eger、Wolfgang Schütt以及IMC大学的Harald Hundsberger、Czech 科学院的Jiri Kopecky，感谢他们慷慨提供数据。

参考资料
1. Rasool, M.; Sabina, E. P.; Lavanya, B. Biol Pharm Bull  2006,29(12), 2483  
2. Romay, C.; Armesto, J.; Remirez, D.; Gonzalez, R.; Ledon, N.; Garcia, I.  Inflamm Res 1998, 47(1), 36.[31] 
3.  Prinsep, M. R.; Thomson, R. A.; West, M. L.; Wylie, B. L. J Nat Prod  1996, 59(8),