从头组装+蛋白分析=转录组新发现

来自马普研究院等处的研究人员针对基因组特别大， 难以进行测序的动物，提出了一种新技术策略——将转录组与蛋白质组联系在一起，由此开启解析这些动物奇特基因组的神奇之旅。相关成果公布在1月20日Genome Biology杂志上。

　　

生物通报道：来自马普研究院等处的研究人员发表了题为“A de novo assembly of the newt transcriptome combined with proteomic validation identifies new protein families expressed during tissue regeneration”的文章，针对基因组特别大， 难以进行测序的动物，提出了一种新技术策略——将转录组与蛋白质组联系在一起，由此开启解析这些动物奇特基因组的神奇之旅。相关成果公布在1月20日Genome Biology杂志上。

蝾螈这种颇不起眼的动物有一种非凡的本领：当它失去一条腿，或者心脏和眼睛的部分组织的时候，能重新开启基因，令新细胞生长，由此弥补缺失的组织和器官。了解这一过程的分子作用机制，将有助于治疗人类疾病。然而这其中涉及的基因，目前对于科学家们来说还是一个谜。

近期一个由马普研究院Thomas Braun领导的研究组破解了这一领域一些方面的谜题，研究人员将几种方法结合起来，发现了再生过程中编码相应蛋白的一些基因。这种研究策略令研究人员发现了以写之前从未在其他生物中发现的新蛋白。

此前研究人员一直在努力寻找蝾螈的再生基因，但因为这种动物有着一个庞大的基因组，因此成效不显。“蝾螈的基因组比较大，”Braun说，“其大小是哺乳动物基因组的10倍，因而要想进行大规模测序，就生物信息学方面来说就很困难。”

因此，这一研究组决定放弃全基因组测序，而是将精力集中于蝾螈的转录组上。基因组包含有许多成分，比如不能翻译成蛋白的内含子等，研究人员以120,922个非冗余转录子为基础，从头进行组装，这些外显子包含了不同器官所有再生阶段的转录子。这些转录组成分中的部分内容与其它生物的相似。

但是Braun和他的同事们希望能了解更多信息，不仅仅是转录组，还有参与再生过程的特异性蛋白——一些转录内容并不一定会被翻译成蛋白。因此研究人员从蝾螈组织，包括心脏，眼睛的晶状体，尾，肝脏，脾脏中分离得到了再生过程表达的蛋白。根据这些蛋白的特征，研究人员利用质谱分析方法，进行了分类，并将其与转录蛋白序列进行了比对。

“这项研究真正的亮点在于，我们将两种不同的研究技术结合在了一起，”Braun说，“利用转录组和蛋白组学，我们获得了更全面的了解。”

研究人员分析了与14,471个转录子相匹配的55,605个肽段，其中超过10,000个转录子编码多种蛋白，还有500多肽段在其它生物中从未被发现过。

“这的确是一个惊喜，因为并没有发现相应的许多未知基因，”Braun说，“不过这与再生能力是否存在直接关联，目前还不清楚。”

到目前为止，这项研究其实并未给出蝾螈等相关动物如何对这么多身体部分进行组织再生的答案，而是提出了出发点，因为目前科学家们缺少这种两栖类动物的基因数据，但是这项研究成功的将转录数据，与蛋白质组学数据联系在了一起，这将为基因组测序困难的动物研究，提出了一种新思路。

Braun说，“有不少基因组特别大的动物，尤其是两栖类动物，而这种技术策略能帮助研究它们。”（生物通：张迪）

原文摘要：

Looso M, Preussner J, Sousounis K, Bruckskotten M, et. al. A de novo assembly of the newt transcriptome combined with proteomic validation identifies new protein families expressed during tissue regeneration. (2013) Genome Biology 14:R16.

A de novo assembly of the newt transcriptome combined with proteomic validation identifies new protein families expressed during tissue regeneration

BACKGROUND: Notophthalmus viridescens, an urodelian amphibian, represents an excellent model organism to study regenerative processes, but mechanistic insights into molecular processes driving regeneration have been hindered by paucity and poor annotation of coding nucleotide sequences. The enormous genome size and the lack of a closely related reference genome have so far prevented assembly of the urodelian genome.

RESULTS:
We describe the de novo assembly of the transcriptome of the newt Notophthalmus viridescens and its experimental validation. RNA pools covering embryonic and larval development, different stages of heart, appendage and lens regeneration, as well as a collection of different undamaged tissues were used to generate sequencing datasets on Sanger, Illumina and 454 platforms. Through a sequential de novo assembly strategy, hybrid datasets were converged into one comprehensive transcriptome comprising 120,922 non-redundant transcripts with a N50 of 975. 38,384 putative transcripts were annotated and around 15,000 transcripts were experimentally validated as protein coding by mass spectrometry based proteomics. Bioinformatical analysis of coding transcripts identified 826 proteins specific for urodeles. Several newly identified proteins establish novel protein families based on the presence of new sequence motifs without counterparts in public databases, while others containing known protein domains extend already existing families and also constitute new ones.

CONCLUSIONS:
We demonstrate that our multistep assembly approach allows de novo assembly of the newt transcriptome with an annotation grade comparable to well characterized organisms. Our data provide the groundwork for mechanistic experiments to answer the question whether urodeles utilize proprietary sets of genes for tissue regeneration.