Biotechniques盘点2012十大最受欢迎的技术文章

　　

生物通报道：2012年BioTechniques发表了大量的方法技术类论文，包括无细胞蛋白表达和无文库DNA测序等等，进一步推动了生命科学领域的技术创新，以及新技术的推广和应用。日前，BioTechniques杂志盘点了2012年最受欢迎的技术类论文以飨读者。

其中通过原位杂交ISH定量分析microRNA表达的文章受到了最广泛的关注，利用这一技术人们现在无需提取细胞总RNA就能够直接检测上皮性肿瘤的miRNA表达。该方法由耶鲁大学病理学家David L. Rimm的实验室提供。下面就是BioTechniques推荐的2012年10篇最受欢迎的同行评议论文：

1. “Quantitative analysis of microRNAs in tissue microarrays by in situ hybridization,” by Hanna et al.

MicroRNA是癌症发病机制中的关键调控子，目前绝大多数miRNA检测法都需要提取总RNA，但这样就缺失了关键的空间信息。研究人员通过原位杂交定量分析法，来直接评估上皮性肿瘤的miRNA表达，并对这一方法进行了验证。该方法称为qISH，使用DAPI和细胞角蛋白免疫荧光对上皮性肿瘤细胞进行区域划分，然后通过多重miRNA ISH对各区域中的miRNA表达进行定量检测。

2. “Length and GC-biases during sequencing library amplification: a comparison of various polymerase-buffer systems with ancient and modern DNA sequencing libraries,” by Dabney and Meyer.

研究人员在制备Illumina人类基因组DNA测序文库的过程中，对十种不同PCR聚合酶/缓冲体系进行了系统性和综合性评估，分析了这些体系对两种PCR偏好性的影响（GC含量和片断大小）。此外，他们还详细评估了一系列PCR 聚合酶/缓冲液体系在建立古代人类DNA测序文库中的表现。古代DNA样本是一种极端情况，因为样本质量差会严重放大PCR偏好性的影响。但令人惊讶的是，在GC含量和片断长度偏好性上表现最糟糕的就是以往最广为推荐适宜Illumina文库构建的PCR聚合酶，对现代和古代DNA样本来说都是如此。不过，文章也推荐了最佳PCR 聚合酶/缓冲液体系，这对于正在进行第二代测序的研究者们来说非常宝贵。（相关文章：2012最受欢迎的测序文章，点滴决定成败）

3. “Automated high multiplex qPCR platform for simultaneous detection and quantification of multiple nucleic acid targets,” by Hlousek et al.

能够实时监控扩增的定量PCR（qPCR）在单个循环中检测的目标种类并不多。ICEPlex系统是基于可扩展靶体扩增规程(STAR)技术的自动化高通量、高复用性分子检验系统。ICEPlex在一个集成系统中将PCR、连续分离扩增子的毛细管电泳和二色定量检测结合在一起。该系统能够同时量化mRNA、microRNA和DNA，每个颜色通道能够分离100至500bp的扩增子超过50个。可用于分析病毒DNA或RNA，检测基因突变，或反转录PCR基因表达平台。

4. “Visualization of cofilin-actin and Ras-Raf interactions by bimolecular fluorescence complementation assays using a new pair of split Venus fragments,” by Ohashi et al.

双分子荧光互补分析BiFC可在活细胞中观察蛋白质互作，而GFP的突变体Venus（呈黄色）是该技术中的常用荧光蛋白。研究人员为了更好的观察活细胞中cofilin丝切蛋白与actin肌动蛋白之间的相互作用，对不同Venus片段的组合进行了大量筛选，最终确定Venus (1-210) 融合cofilin上游和Venus (210-238)融合actin下游是最有效的组合。

5. “U-2012: An improved Lowry protein assay, insensitive to sample color, offering reagent stability and enhanced sensitivity,” by Upreti et al.

Lowry法等传统的比色法蛋白定量不适用于有颜色的生物学样本。研究人员对Lowry 蛋白定量法进行了改进，并将改进后的方法称为U-2012。该方法使用了更稳定的试剂，不仅规避了颜色和糖类等物质的干扰，而且还更佳灵敏。用这一方法，通过蛋白标准曲线可以测得红酒和蓝莓匀浆中的蛋白含量。

6. “High-resolution three-dimensional reconstruction of a whole yeast cell using focused-ion beam scanning electron microscopy,” by Wei et al.

这项研究通过扫描电镜对整个酵母细胞进行了高分辨率成像。研究人员对酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae进行了研究，得到了许多亚细胞结构/器官的高分辨率数据，包括内质网、细胞壁、液泡和线粒体的体积、体积百分比和表面积。现在人们可以很容易的识别线粒体和内质网相互连接的位点。该研究以高分辨率对整个真核细胞进行了分割和量化，为人们提供了细胞内机制的新视点。

7. “Identification of artifactual microarray probe signals constantly present in multiple sample types,” by Mao et al.

8. “Simultaneous multiple target detection in real-time loop-mediated isothermal amplification,” by Tanner et al.

9. “Technique for strand-specific gene-expression analysis and monitoring of primer-independent cDNA synthesis in reverse transcription,” by Feng et al.

10. “Direct sequencing of small genomes on the Pacific Biosciences RS without library preparation,” by Coupland et al.

研究人员在Pacific Biosciences公司的RS测序仪上开发了无需标准文库制备的小DNA分子测序方法。这一技术被用于测序单链或双链病毒基因组、细菌质粒、质粒载体和覆盖整个细菌基因组的线性DNA片段。此前的测序方法一般需要400-500 ng DNA来进行文库制备，而该技术通过直接测序，能够仅从1ng DNA得到测序数据。（详见：无需建库，直接测序的测序新技术）