Nature methods：原位RNA成像技术（二）

　　

生物通报道  观测RNA可为研究人员带来许多新的认识。存在于特殊细胞以及这些细胞特殊位点中的RNA可以揭示潜藏在差别背后的机制。在癌症和其他疾病中，RNA转录物有时会被发现存在于错误的地方。“这就是为什么大家会对RNA的定位感兴趣的原因，然而RNA成像一直是一个挑战，”威尔康乃尔医学院从事RNA调控研究的Samie Jaffrey说。

上接：Nature methods：原位RNA成像技术（一）

van Oudenaarden利用RNA FISH在小鼠肠冰冻切片上显示了作为三种类型干细胞标记的转录物在隐窝中的分布。肠隐窝常被用于研究再生和分化。利用原位RNA，可以快速挑选出大量的标记物，组合观测它们看看哪些独特地识别了不同的细胞类型；用荧光蛋白标记完成同样的事情将是不太可能或不切实际的。van Oudenaarden.说：“无需遗传修饰任何东西，你就可能获得大量的进展。这相当的容易。我们开玩笑说我们甚至不是生物化学家。”他说难的是设计成像系统和相应的软件。

第一个普遍应用的RNA FISH探针是利用质粒来生成反义RNA，其掺入的修饰核苷酸结合到了随后可以被标记的抗体上。阿尔伯特爱因斯坦医学院的Robert Singer实验室构建出了另一种方法，用酶将荧光核苷酸类似物掺入到长双链DNA分子。他们后来改良了这一技术利用几组更小的合成DNA探针，每种探针大约50个核苷酸长，标记着一些小分子荧光基团。

这种方法被van Oudenaarden'的前博士后Arjun Raj进一步改良，他和新泽西医学与牙科大学的Sanjay Tyagi设计出了更短的用于RNA FISH的寡核苷酸。这一系统利用数组约50种左右的探针，每种靶向转录物不同的部分。这些探针大约20个核苷酸长，用单个荧光基团修饰，更易于穿透细胞，相比于长探针制造更便宜更快速。然而，这种策略不能靶向短于约800个核苷酸的转录物，因为较少标记的转录物很难看见。

Tyagi说利用更短的、逐个衍生的探针在固定细胞中生成RNA标记更易于处理。“这是一个简单的步骤可以解决大问题。由于寡核苷酸合成已经变为自动化，你可以在96孔板中生成寡核苷酸。”他补充说更多更小的探针提供了其他的利益。例如，一种探针的结合松解了转录物使得其他的探针更易于结合。并且并不是每个探针都需要是完美的，“你得到的是所有或大多数探针结合的信号，非不是一个或两个错误结合的信号。”

Biosearch Technologies公司在去年9月推出了短的逐个标记的探针Stellaris FISH。在研究人员在线输入他们需要的转录物的序列后，公司的软件会设计出数组多达48种探针来标记它。Biosearch提供8种荧光基团选择，从蓝色到红色，研究人员也可以购买为标记的衍生探针，自己添加荧光基团。例如，van Oudenaarden将特异的基团附着到了波谱的红色端，从而可以与蓝色的核及绿色标记的蛋白一并成像。Tyagi在同一套探针内利用两种不同的基团检测了RNA加工事件，例如选择性剪接形式。相似的方法可以鉴别融合基因。

Biosearch Technologies 公司企业发展部主任Marc Beal 说5纳摩尔的混合定制寡核苷酸的标准定价为575美元，足够进行500-2000次反应。Beal说该系统可以与各种荧光显微镜包括广野显微镜和共聚焦显微镜一起使用，可用于冰冻、石蜡包埋组织样品以及培养细胞。采用油浸透镜可将“RNA点”放大60-100倍。Biosearch也正在开发一种可自动分析的专利成像系统。

（生物通：何嫱）

生物通推荐原文摘要：

RNA imaging in situ

With RNA, as with many things, seeing can bring understanding. The presence of RNA in particular cells and sites within those cells can reveal mechanisms behind differentiation. In cancer and other diseases, RNA transcripts are sometimes found in the wrong places. “That's why everyone is interested in RNA localization, and the challenge has been to image the RNA,” explains Samie Jaffrey, who studies RNA regulation at Weill Cornell Medical College.