凋亡聚焦：选择合适的TUNEL分析[选购指南]

DNA片段化是凋亡的一个重要特点。提起DNA片段化的检测，大家自然会联想到TUNEL。TUNEL的全称为Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling，即脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）介导的缺口末端标记法。1992年，三名以色列科学家在JCB杂志上首次提出了片段化DNA的原位检测方法，但这种方法饱受争议，因为它无法区分凋亡细胞和坏死细胞。几年后，方法经过改进，演化成现在的TUNEL分析。也就是说，TUNEL分析已经有整整20年的历史了。

TUNEL技术的原理是染色体DNA断裂时产生大量的粘性3'-OH末端，而生物素或荧光素标记的dUTP在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）的作用下掺入到DNA的3'-末端，并通过一定的显色系统使之显示出来。这种方法较电泳法来说更为灵敏，荧光显微镜能检测到单个细胞，流式细胞仪也能检测约100个细胞。市场上的TUNEL分析有很多种，究竟如何选择，且听本文分解。

考虑您的样品类型

您首先要考虑的是哪个TUNEL分析最适合您的样品类型。一些厂家为不同的样品类型提供预先优化的试剂盒。例如，BioVision提供了适用于细胞、组织、切片及FFPE样品的试剂盒：ApoBrdU™ DNA Fragmentation Assay Kit、ApoBrdU Red™ DNA Fragmentation Kit、ApoBrdU-IHC™ DNA Fragmentation Assay Kit和ApoDIRECT™ DNA Fragmentation Assay Kit。所有试剂盒都提供了完整的组分，包括阳性对照和阴性对照细胞或玻片，便于DNA片段化的检测。

ApoBrdU分析采用两色的TUNEL方法，以检测凋亡细胞的DNA链断裂。ApoBrdU Red采用相同原理，但是为包含GFP的细胞设计的。ApoBrdU-IHC™则顾名思义，适合免疫组化分析。ApoDIRECT™分析则提供了凋亡细胞的一步标记，适合流式分析。

在处理组织时，专门的试剂盒可能更为有用，因为组织类型通常变化很大。体内的每种组织都有其独特的结构和物理特性，这与其特定功能相关。因此，不同的组织需要不同的制备条件，以便随后的生物学分析。为此，美国Trevigen提供了多种组织特异的试剂盒，包含了专为特定组织类型而优化的试剂和操作步骤，如适用于神经组织的NeuroTACS™、心肌组织的CardioTACS™、血管组织的VasoTACS™、肿瘤组织的TumorTACS™和皮肤组织的DermaTACS™。通过透化试剂的选择和阳离子系统的优化，提高了检测系统的敏感性，降低了背景和坏死细胞的着色，也大大节省了客户优化操作的时间。目前这一系列产品也可通过R&D Systems购买，索取资料。

考虑通透性和标记

试剂的膜通透性和缺口DNA的标记，也是值得考虑的因素。过去，分析中的dUTP通常是经过生物素或荧光素标记，但最近几年，多个厂家都推出了升级产品。他们以Br-dUTP来取代生物素或荧光素标记的dUTP，在TdT酶的作用下掺入到凋亡DNA片段的3'-末端。因为溴分子比荧光素、生物素或地高辛标记等标记物要小得多，因此Br-dUTP更容易掺入凋亡细胞的DNA片断中，而最后的检测信号也更强。

这一系列的代表产品有：默克密理博的Apo-BrdU™ Kit、Life Technologies的APO-BrdU™ TUNEL Assay Kit、BD的Apoptosis Detection Kit (APO-BRDU)，以及Sigma-Aldrich的APO-BRDU™ Kit等。除了Life Tech的产品采用Alexa Fluor® 488标记的BrdU抗体外，其他试剂盒均采用FITC标记的抗体。这些产品的规格均为60次检测，价格在6000-9000元不等。

此外，Life Tech还独家推出了一款Click-iT® TUNEL Assay。它采用经过炔烃修饰的dUTP，比Br-dUTP更小，因此更容易被TdT掺入。而检测也不是基于BrdU与抗体之间的反应，而是基于点击（Click）反应，一种铜催化的叠氮化物与炔烃之间的反应。与BrdU抗体（分子量约为150 kDa）相比，Alexa Fluor® 叠氮化物的大小仅为1%（分子量<~1000 Da）。因此只需要使用温和的固定和透化条件，即可实现试剂的渗透。

据Life Tech介绍，与其他方法相比，Click-iT® TUNEL Assay在相同条件下能够检测更高比例的凋亡细胞。整个过程也很快，大约在3小时内完成。Click-iT® TUNEL Assay提供三种不同的荧光染料：Alexa Fluor® 488（绿色）、Alexa Fluor® 597（橙色）和Alexa Fluor® 647（红色）。此试剂盒足够开展1x96次检测或50块盖玻片，价格为9820元。

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考虑检测方法

TUNEL分析一般采用显色法或荧光检测法。每一种都有其各自的优缺点，因此选择哪一种取决于您的需求。荧光检测感更为灵敏，但难以保留信号。由于成像时的光漂白，且随着时间的流逝，荧光信号会逐渐丧失。荧光信号也会有更高的背景问题，这要取决于组织类型。显色分析适用于组织切片，因为可以使用光学显微镜，并且您可以开展进一步的形态学分析，并永久记录。

显色检测

市场上有多个显色检测试剂盒可供选择，特别是原位或组织研究。罗氏就提供了四种版本的In Situ Cell Death Detection Kit，两个荧光版本：荧光素和TMR Red；两个显色版本，分别利用过氧化物酶或碱性磷酸酶检测。

上文也提到过，R&D Systems/ Trevigen推出了适合不同组织的试剂盒，其中包含了显色检测试剂和复染剂，使对比度更高。其中，TACS XL® Kit提供了两种显色底物，分别为：TACS-Blue Label™或DAB。TACS-Blue Label是一种即用型的检测试剂盒，灵敏度比DAB更高，但不是永久的染料。如果组织和结果需要存档，那还是DAB更合适。

此外，R&D Systems/ Trevigen还提供两种可定量的TUNEL试剂盒，TiterTACS™ 和FlowTACS™。TiterTACS™利用酶标仪测定吸光度变化，可定量特定细胞群体中的凋亡信号，适合培养中的贴壁细胞。FlowTACS则包含荧光素标记的链霉亲和素，在与PI结合使用时，可利用流式细胞仪来定量凋亡细胞。FlowTACS适合悬浮细胞以及解离的贴壁细胞。

荧光检测

荧光相对显色检测的一个好处是多重检测，这样能节省时间和材料，让各个反应在相同的实验条件下开展。这对于验证凋亡结果特别重要。上面提到过，Click-iT® TUNEL Assay就提供三种不同颜色：绿色、橙色和红色。Alexa Fluor® 染料可是Life Tech的旗舰产品，比其他荧光染料更明亮更稳定。

除了两种荧光的In Situ Cell Death Detection Kit，罗氏还推出了一种新的DNA片段化成像试剂盒。此试剂盒可快速检测哺乳动物细胞的凋亡，适合中等至高通量的分析。操作步骤经过改善，洗涤步骤更少，细胞损失的风险也就更低。对于一块96孔板的分析，所需的总时间仅为85分钟。它适用于手动的显微镜或自动的成像系统，如罗氏的Cellavista系统。试剂盒还提供了细胞核染料Hoechst 33342，可染色活细胞和死细胞的核，这样即可同时确定细胞总数以及凋亡细胞的比例。欢迎索取资料

由此可见，TUNEL分析的选择可真不少，大家可根据自己的样品、仪器，参考价格、售后等因素，自由地挑选。（生物通 余亮）