FFPE样品制备和分析宝典（二）[心得点评]

本文介绍了制备和保存FFPE样品的方法，其目的在于尽量减少因固定和包埋过程而引起的DNA、RNA和蛋白质量下降。之后介绍了流程中的提取和分析步骤，并详细介绍了如何高效地从FFPE样品中回收可分析的生物分子，以及需要作出哪些必要的修改，以便开展逆转录和实时定量PCR等下游应用。专家巨献，FFPE分析宝典，绝对不容错过！

全世界福尔马林固定、石蜡包埋（FFPE）组织切片的存档代表了珍贵且来源广泛的生物医学研究材料。随着越来越多的研究人员转向FFPE样品的分子分析，开发特定的操作步骤，考虑这些样品的独特性质就变得越来越重要。

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二、从FFPE样品中提取有用分析物的的关键因素

从FFPE样品中纯化DNA、RNA和蛋白时，目前存在一些主要困难。首先，这些生物分子彼此交联。交联程度和不可逆交联的比例取决于，或部分取决于，福尔马林固定的持续时间。其次，核酸常常严重片段化，这取决于FFPE样品如何制备和保存。第三，由于FFPE样品很珍贵，故只有有限的材料可用于分析物纯化和下游分析。因此，所用的纯化步骤必须是高效的，尽可能多地回收有用的分析物。本章介绍了从FFPE样品中纯化DNA、RNA和蛋白的独特挑战，以及如何最有效地克服它们。

1 脱蜡

从FFPE样品中纯化核酸和蛋白之前，需要开展脱蜡。在此过程中，先溶解石蜡，然后去除，暴露样品，用于后续裂解缓冲液和蛋白酶K（如果合适）的处理。多种溶剂适用于脱蜡，而溶剂的选择取决于后续开展的纯化步骤。

对于DNA或RNA的纯化，包括用蛋白酶K消化样品，让核酸与硅胶模结合，可选择各种疏水溶剂用于脱蜡。具体包括二甲苯、庚烷和柠檬烯。对于FFPE样品的蛋白纯化，如果蛋白用于western blotting等下游应用，二甲苯脱蜡很合适。不过，对于2D-PAGE等苛刻应用，只能使用庚烷，才能确保非常高效的脱蜡。

从FFPE样品中纯化DNA或RNA之前，使用QIAGEN的新型脱蜡溶液，可实现更为方便的脱蜡。在加入FFPE样品之后，溶液仍在样品上，同时可开展蛋白酶K消化。在加入脱蜡溶液后无需沉淀FFPE样品，也无需去除包含石蜡的上清。因此避免了脱蜡过程中损失样品的风险。

作为溶剂法的替代，石蜡也可通过加热与FFPE样品分离：熔化后，石蜡冷却，取决于其用量，石蜡粘在管壁上，或在样品上形成一个固体层。

福尔马林交联限制了生物分子的纯化

图6. 福尔马林固定对DNA、RNA和蛋白的影响。福尔马林固定导致核酸之间、蛋白之间以及核酸和蛋白之间的交联。固定时间越长，交联程度越大。

2 基因组DNA的纯化

由于FFPE样品包含的DNA分子会彼此交联，并与RNA和蛋白分子交联，故这些交联必须断裂，才能释放出DNA用于后续纯化。如果可能的话，因交联而引起的化学修饰也应当逆转，因为化学修饰的DNA不能在纯化过程中高效回收，而且在PCR或其他酶学分析中是一个不佳的底物。然而，在断裂交联和逆转化学修饰时必须小心，因剧烈的反应条件可能导致DNA的进一步片段化。

QIAamp® DNA FFPE Tissue Kit提供了一个克服交联的有效方法，此试剂盒是特别为FFPE样品的基因组DNA纯化而设计的。样品先用蛋白酶K在56°C处理1小时，这一步通过消化交联蛋白而释放DNA。接着是优化缓冲液中的90°C孵育，这可部分逆转交联：在孵育过程中，氨基之间的亚甲基桥断裂，且释放出的甲醛分子与受体分子结合。

尽管过度加热会导致DNA降解，但QIAGEN的研究表明，在90°C孵育1小时可实现可分析基因组DNA的最佳回收（图7和8）。数据还显示，56°C的1小时孵育加上90°C的1小时孵育使蛋白酶K过夜孵育不再成为必需。

图7. 基因组DNA的最佳回收。大鼠肝脏的FFPE切片用蛋白酶K在56°C处理1小时，之后按图中所示的条件孵育。作为对照，一个样品与蛋白酶K在56°C孵育过夜。利用QIAamp DNA FFPE Tissue Kit纯化基因组DNA，并利用分光光度计确定DNA产量。与80°C孵育和56°C的过夜孵育相比，90°C孵育实现了DNA的更佳回收。

图8. 从FFPE组织中回收可用的基因组DNA。大鼠肝脏的FFPE切片用蛋白酶K在56°C处理1小时，之后按图中所示的条件孵育。利用QIAamp DNA FFPE Tissue Kit纯化基因组DNA，并用QuantiTect® SYBR Green PCR Kit和Pmp2基因特异的2对不同引物开展SYBR Green® 法实时定量PCR。生成的扩增子为78 bp或464 bp。90°C孵育产生的CT值比80°C孵育更低：这表明更高温的90°C孵育在逆转交联上更为有效，提供了更多有用的DNA，供实时定量PCR分析之用。作为对照，一个样品与蛋白酶K在56°C孵育过夜。

在2步孵育之后，DNA可利用QIAamp MinElute® 离心柱纯化：在硅胶模上分离DNA，洗涤以去除污染，之后以20-100 μl的小体积洗脱。另外，当DNA与硅胶模结合之前，也可开展样品的RNase A消化。如果DNA的下游应用对RNA污染敏感，则需要这一步。如果纯化的DNA需要通过分光光度计定量，也需要RNase A消化，因为RNA污染也会贡献吸光值读数，导致DNA产量的过高估计。为了提高标准化和便利性，QIAamp DNA FFPE Tissue Kit所开展的DNA纯化必要时也可在QIAcube® 上自动开展。

尽管最佳的裂解和孵育条件可从FFPE样品中释放DNA，部分逆转甲醛修饰，但对于纯化后DNA的下游分析，仍有一些限制。首先，固定过程中的化学修饰可能引入不想要的序列变化，降低DNA稳定性和酶学分析的效率，让A260/A280的纯度分析变得困难。其次，由于FFPE样品中的DNA随时间而逐渐片段化，故只能分析短序列（例如在PCR应用中，应当设计产生短扩增子的引物）。此外，较短的DNA片段可能导致DNA产量的过高估计，因吸光值读数更高。

注意：QIAamp DNA FFPE Tissue Kit适用于从福尔马林固定样品中纯化DNA。它不适用于用其他彻底破坏DNA的试剂固定的样品，如苦味酸。

3 全基因组扩增

FFPE样品的珍贵特性意味着只有少量DNA能够纯化，这限制了我们能够开展的分子分析的数量。DNA样品量的增加可通过全基因组扩增（WGA）来实现，其中整个基因组是利用一种高度进行性的DNA聚合酶扩增的。然而，从FFPE样品中片段化的DNA开始时，这是一个挑战。

REPLI-g® FFPE Kit采用了一种改进的WGA方法，实现了FFPE样品中基因组DNA的扩增，且不需要预先的DNA纯化。片段化DNA先随机连接，形成更高分子量的DNA分子。随后利用一种高度进行性的DNA聚合酶来开展WGA。尽管DNA片段未按照正确的顺序拼接，但假如分析方法稍作修改，还是能在某些应用中实现可靠的DNA分析。例如，如果引物设计成产生尽可能短的扩增子，那么可开展PCR和实时定量PCR分析（图9）。尽管数据显示了358 bp片段的成功PCR扩增，但我们建议PCR分析的扩增子在100 bp左右，因为FFPE样品中的DNA严重片段化，且甲醛修饰会减少可读取DNA序列的长度。

图9. 利用FFPE组织中的基因组DNA开展的可靠PCR和实时定量PCR。A 6个人肝脏FFPE样品（11年）经过REPLI-g FFPE Kit的全基因组扩增。产生的DNA样品随后用于终点PCR，利用QIAGEN Fast Cycling PCR Kit在Eppendorf® Mastercycler® ep gradient S上开展，以扩增358 bp的序列。1-6：DNA样品；N：无模板对照；M：marker。B 2个人肝脏FFPE样品（11年）经过REPLI-g FFPE Kit的10次独立全基因组扩增反应。随后利用QuantiFast SYBR Green PCR Kit 和Stratagene® Mx3005P® 循环仪开展实时定量PCR，以扩增100 bp的序列。

4 亚硫酸氢盐转化

表观遗传学DNA甲基化分析中的第一步是开展亚硫酸氢盐转化，其中未甲基化的胞嘧啶被转化成尿嘧啶。由于甲基化的胞嘧啶不受亚硫酸氢盐转化的影响，故可通过PCR或实时定量PCR来检测，或焦磷酸测序（Pyrosequencing®）来检测和定量。然而，亚硫酸氢盐转化需要在高温和低pH值下孵育，因此可能发生DNA的片段化。在研究来自FFPE样品的早已严重片段化的DNA时，这可能是个问题。

EpiTect® Plus FFPE Bisulfite Kit具有一些独特之处，可实现FFPE样品中DNA的最佳回收，并提供最大程度的亚硫酸氢盐转化，而不会导致DNA进一步降解。首先，此试剂盒采用一种优化的脱蜡步骤，它能最大限度地减少操作，节省时间，并尽可能提高DNA产量。在脱蜡之后，样品先用蛋白酶K在56°C处理30分钟，通过消化交联蛋白而释放DNA。之后在一种新颖的缓冲液中95°C孵育1小时，以部分逆转交联：在孵育过程中，氨基之间的亚甲基桥断裂。尽管过度加热会导致DNA降解，但QIAGEN的研究表明，在95°C孵育1小时可实现基因组DNA的最佳回收，DNA无需进一步纯化，可直接用于亚硫酸氢盐转化步骤。通过创新的DNA保护技术，可防止亚硫酸氢盐转化过程中的化学DNA降解。

图10. FFPE样品中的DNA经亚硫酸氢盐转化之后的PCR分析。利用EpiTect Plus FFPE Bisulfite Kit或供应商Z的同类试剂盒从大鼠FFPE肝脏组织（10 μm）中纯化DNA。A 利用PyroMark® PCR Kit开展终点PCR，以检测指定的基因。琼脂糖凝胶分析表明，利用EpiTect Plus FFPE Bisulfite Kit纯化得到的模板，比同类试剂盒相比产量更佳且高度一致。B 利用QuantiTect SYBR Green PCR Kit开展实时定量PCR反应，以检测GSTP基因的2个大小不同的扩增子（156和279 bp）。每个反应在4个样品上开展，重复三次。左边的扩增子曲线表明，利用EpiTect Plus FFPE Bisulfite Kit纯化得到的模板，两个扩增子的CT值都较低，且结果高度重复。而利用同类试剂盒纯化得到的模板，只有156 bp片段成功扩增，且CT值较高（右）。

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原文《Critical factors for molecular analysis of FFPE samples》由QIAGEN提供，生物通负责编译。

（未完，待续）