胡红雨组PLoS获蛋白拓扑结构分析新方法

　　

生物通报道：来自上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所的研究人员发表了题为“A Redox-Sensitive Luciferase Assay for Determining the Localization and Topology of Endoplasmic Reticulum Proteins”的文章，应用氧化还原敏感的Gaussia荧光素酶和绿色荧光蛋白GFP，报告融合蛋白所处的不同氧化还原环境，从而鉴定目标蛋白质在细胞内的亚定位及其拓扑结构。相关成果公布在PLoS ONE杂志上。

领导这一研究的是上海生科院生物化学与细胞生物学研究所胡红雨研究员，其研究组主要研究方向是蛋白质错误折叠、淀粉样积聚和降解作用的分子机制及与神经退行性疾病的关系。第一作者是博士生李海音，这项研究得到了国家科技部、中国科学院和国家基金委的经费支持。

真核细胞中约有三分之一的蛋白质进入内质网进行折叠、修饰、膜整合、转运和分泌，内质网内和跨膜蛋白在这些过程中发挥着重要的功能。但是，由于跨膜蛋白疏水区域与膜脂结合的复杂性，以及内质网蛋白质的动态性，现有的鉴定内质网蛋白的定位和跨膜拓扑结构的方法非常有限，且存在操作技术繁琐等问题。

Gaussia荧光素酶（Gluc）是近年报道的分子量最小、活性很高的荧光素酶，含有五对二硫键，需要在内质网的氧化环境中才具有完全的发光活性。

在这篇文章中，研究人员利用Gluc的发光活性对氧化还原敏感的特性，将Gluc与GFP串联表达作为新的报告基因，融合于内质网跨膜蛋白的不同位点，并在HEK 293T细胞中表达。他们以Gluc的发光活性检测融合位点的氧化还原环境，而用GFP的荧光强度检测融合蛋白的表达量，从而报告不同融合位点的相对氧化还原环境。

该方法可用于区分其定位于内质网或者细胞质，以此鉴定内质网蛋白的定位和拓扑结构，已成功应用于单次跨膜蛋白（如calnexin、Sec61g 和CD3δ）和多次跨膜蛋白（如Herp和HRD1）的拓扑结构。该方法灵敏度高、简单快速，使内质网蛋白拓扑结构的高通量鉴定成为可能。

也可进一步应用于鉴定细胞膜蛋白的拓扑结构，以及检测蛋白质分泌途径中的氧化还原环境变化，将为研究蛋白质在内质网中的定位、折叠、氧化还原和修饰，以及动态的膜整合、转运和分泌提供更加适用、方便和高效的生化和细胞分析技术。

（生物通：万纹）

原文摘要：

A Redox-Sensitive Luciferase Assay for Determining the Localization and Topology of Endoplasmic Reticulum Proteins

Correct localization and transmembrane topology are crucial for the proteins residing and functioning in the endoplasmic reticulum (ER). We have developed a rapid and convenient assay, based on the redox-sensitive luciferase from Gaussia princeps (Gluc) and green fluorescence protein (GFP), to determine the localization or topology of ER proteins. Using the tandem Gluc-GFP reporter fused to different positions of a target protein, we successfully characterized the topologies of two ER transmembrane proteins Herp and HRD1 that are involved in the ER quality control system. This assay method may also be applicable to the proteins in secretory pathway, plasma membrane, and other compartments of cells.

作者简介：

胡红雨

研究员，研究组长，博士生导师

个人简介：
1987年毕业于复旦大学生物系，1990年复旦大学化学系硕士学位，1993年获中科院上海生化所博士学位。1993-1994年任中科院上海生化所助研，1994-1996年在香港科技大学生化系做博士后研究。1996-2000年任中科院上海生化所副研究员，2000年6-12月在美国康涅狄格大学医学中心NMR结构生物学实验室做访问学者。2001年起任中科院上海生化与细胞所研究员。2002年10月-2003年4月香港科技大学生化系访问学者。2004年9月-12月美国Scripps研究所分子与实验医学系访问学者。2005年起，国际刊物Protein & peptide Letters和Acta Biochem. Biophys. Sinica编委(Editorial Board Member)。

研究方向：蛋白质错误折叠和降解作用

研究工作：

蛋白质错误折叠、淀粉样积聚和降解作用的分子机制及与神经退行性疾病的关系。神经退行性疾病(如帕金森症)的发生与神经细胞内的蛋白质的错误折叠、异常积聚和包涵体形成有关。本课题组着重研究神经退行性疾病相关的蛋白质的错误折叠、淀粉样积聚和生物降解作用的分子机制。在结构信息基础上，结合生物化学和分子生物学的实验结果理解蛋白质错误折叠、淀粉样化积聚和生物降解的效应及与神经退行性疾病发生的联系。用核磁共振和其它结构分析法解析蛋白质异常积聚和生物降解过程中的蛋白质或特定结构域的空间结构和这些蛋白质间的相互作用以及生物功能。感兴趣的三个方向：(1) 与帕金森症相关的alpha-突触核蛋白的结构转换、淀粉样积聚和分子识别的机制，抑制alpha-突触核蛋白异常积聚的化合物及抑制作用机理；(2) 泛素-蛋白酶体降解途径中蛋白质相互作用的NMR结构基础及生物功能；(3) 神经退行性疾病相关的蛋白质质量控制。