任罡：电子显微镜技术的新突破

新技术测定单体蛋白质分子的三维空间结构

近日，美国劳伦斯伯克利国家实验室（Lawrence Berkeley National Lab）的一则新闻引起了世界范围内的密切关注，相关的报道被一百多家国际新闻机构广泛转载和评论。该新闻报道了一篇最新发表的关于测定单个蛋白分子三维空间结构方法的论文。

　　

   近日，美国劳伦斯伯克利国家实验室（Lawrence Berkeley National Lab）的一则新闻（http://newscenter.lbl.gov/feature-stories/2012/01/24/3d-protein/ ）引起了世界范围内的密切关注，相关的报道被一百多家国际新闻机构广泛转载和评论。该新闻报道了一篇最新发表的关于测定单个蛋白分子三维空间结构方法的论文。论文的两名作者分别是劳伦斯伯克利国家实验室研究员任罡博士和张磊博士（任罡博士研究小组博士后http://foundry.lbl.gov/rengroup/index.html）。为了证明该方法的实用性，他们分别测定了人体抗体蛋白以及高密度脂蛋白的单个分子的三维密度图，并取得了迄今为止最高分辨率的单个蛋白分子的三维结构。这一结论，打破了近半个世纪以来人类科研史上“单个蛋白分子的有效三维结构不可能获得”的偏见。该方法有望成为解决多形态的蛋白分子结构测定难题的基本方法。该方法通过对逐个确定的单个蛋白三维结构差异进行比较，来研究蛋白质的结构关节，而这些结构关节的信息对生物药物的结构设计有着及其重大的意义。

   一般而言，对于蛋白质结构的测定，主要的科研方法包括X光衍射法、核磁共振谱法，以及传统的单颗粒电镜重构。但这些方法需要获取成千上万的结构全同的蛋白质分子的平均信号或图像来完成，受蛋白质是否结晶、分子量过大或结构是否单一等条件制约，科研人员无法获得任意单个蛋白质个体分子的三维结构，从而无法获得蛋白质的结构关节信息，直接影响对与之密切相关的功能理解。任罡和张磊博士发展了一套测定任意单个蛋白质个体分子的三维结构方法，称之为“Individual-Particle Electron Tomography（单个体蛋白电子断层成像技术，即IPET）”。这是一种利用电子显微断层成像技术有机地结合独立开发的三维结构重构算法研究蛋白质个体分子结构的技术。该项技术的论文发表在2012年1月24日出版的PLoS ONE期刊，题目为《IPET and FETR: Experimental Approach for Studying Molecular Structure Dynamics by Cryo-Electron Tomography of a Single-Molecule Structure》。

单个高密度脂蛋白的三维重构过程。 (A) 系列倾转角度下的蛋白透射冷冻电镜像，三轮迭代后的三维重构结果在相应倾转角下的二维投影像，以及最终结果的侧面图；(B) 最终三维重构结果的放大图；(C) 将脂蛋白的蛋白质部分（三个载脂蛋白A-I）放入最终的三维结果（值得注意的是，载脂蛋白A-I仅由两根并列的螺旋构成）。（D-F）另一个高密度脂蛋白的三维结构重构过程。

    该论文详细描述了IPET的流程细节和重构算法具体步骤，陈述了可以突破电子断层成像方法重构的分辨率极限理论证据，并分析了各种实验误差影响和探讨了传统算法的局限性及其对三维重构分辨率的影响，从而证明了传统所认为的“单个蛋白分子信号不足以重构有结构意义的三维空间密度图”这一观点的片面性。为了证明该方法对真实实验图像处理的实用性，任罡和张磊博士在实验中对两种蛋白质的四个单独的个体分子进行了迄今为止最高分辨率的三维结构测定。该研究成果被多名专家评价为具有开拓性的方法论，而论文的发表对蛋白个体分子的三维结构测定和蛋白质动态结构的研究具有里程碑式的意义。

    任罡博士自1990年开始师从我国著名的理论物理学家段一士教授于兰州大学物理系攻读硕士学位，自1993年师从我国著名的高分辨电子显微学创始人、准晶体的独立发现人之一的郭可信院士于北京科技大学材料物理系攻读博士学位。攻读博士学位期间，任罡博士同时跟随从英国剑桥大学留学归国的彭练矛教授（北大教授、国际电子晶体学学会会长）从事博士论文及相关的科研工作。此期间的学习和获得的培训使任罡博士具备了坚实的高分辨电子显微学理论基础和实验技巧。1997年任罡博士赴美，在美国加州圣地亚哥Scripps研究所细胞生物学系的Alok Mitra研究小组从事AQP1水通道膜蛋白的电子晶体学博士后研究；在2001年初测定了该水通道膜蛋白的原子结构，该项研究对2003年获诺贝尔化学奖的研究工作给予了有力支持，引起轰动，并被科学时报等新闻媒体广泛报道。

   2006年任罡博士在美国加州大学旧金山分校成立了自己的独立研究小组，主攻人体脂蛋白结构的冷冻电子显微镜研究。在此期间，他曾利用单颗粒平均方法获取了低密度脂蛋白的三维结构，该成果引起了业内广泛关注，相关的论文被发表于2010年的PNAS期刊。自2008年底张磊博士的加入开始，任罡博士科研小组将研究方向转向了单个蛋白质个体分子的三维重构方法论，力图攻克高动态性蛋白的结构研究瓶颈。任罡和张磊博士凭借出色的电子显微镜操作技术、坚实的物理学背景、娴熟的数学技巧和计算机编程能力，以及夜以继日的勤奋工作，使研究取得了突破性的进展。不仅首次从实验中获得了分子量极低（小于200 kDa）、尺寸极小（小于20 nm）的人体高密度脂蛋白的冷冻电镜电子断层像；而且利用自主开发的计算机算法，极大地降低了图像的噪声水平，在人类对蛋白质研究历史上，首次获得了单个分子的高分辨的三维重构图。    
     
   与光波波长相比，电子的波长更短，使得利用电子成像的透射电子显微镜可以观察到原子水平的物质细节。任罡博士科研小组主要利用冷冻电镜技术，在零下180度左右的低温下制备并检测样品。在此温度下，液态样品会被快速冷冻到非晶态冰状态，样品最终被固定在直径约3毫米的金属网上非晶碳膜的孔洞中，然后被快速放置于电镜真空腔内。断层扫描像是通过倾转（如从+70°到-70°，以1°间隔倾转）取得整个样品。由于蛋白质的尺寸极小，为了保证成像区域在整个过程中不会偏离，电镜的各种参数必须进行精确的调制。“这就好比将要转动的样品载体放大到整个地球一样的大小，你要跟踪观察的蛋白的尺寸就如地球上的一个戒指大小，而照相的过程就像在操作整个地球的转动，必须保证地球上的这个戒指大小的物体始终保持在观察视野的中心。”任罡博士如是说。在成像过程中，机械的震动、环境的噪音、温度的变化，甚至包括冷冻槽中维持低温用的液氮中的气泡的震动，都要被最大限度地降低，将其引起的机械误差控制在一个微米的范围内才有可能得到一套完整的数据。

   液氮低温不仅可以使蛋白样品被固定在非晶态冰中保持其在自然中的结构状态，还可以使样品在低电子辐照下更好地成像，从而保证蛋白在大约1-2个小时的倾转成像过程中完好无损。

此动画显示了抗体#1的三个分子集团如何动态地变化到抗体#2的状态。

  

   对单个蛋白结构的确定，使得人们可以通过观察同一种蛋白质的不同形态，得到该种蛋白在自然状态下的动态关节；更使得人类研究生物大分子的活性以及结构-功能关系成为可能。为证实这一可能，任罡和张磊博士对两个IgG抗体的三维结构进行了比较，并利用电脑动画进行了演示，此动画显示了抗体一号的三个分子集团如何动态地变化到抗体二号的状态。

  “这好比打开了一道门——一道通往研究蛋白动态性的大门，”任罡博士说，“IPET算法的发表，以及我们正在着手准备的一系列IPET应用的文章，无疑将标志着电子显微镜在生物大分子动态形态结构研究领域的一场革命的开始。一个新时代即将被开启！”

任罡（后一）与张磊在操作电子显微镜。

背景：劳伦斯伯克利国家实验室毗邻于美国著名的加州大学伯克利分校，隶属于美国国家能源部，是一所拥有十三位诺贝尔奖得主、五十七名美国科学院院士、四千两百多名科研人员的国家级科研机构。该实验室与业内研究机构相互合作、人员仪器交流广泛。（图片与动画来源：http://newscenter.lbl.gov/）