PNAS：新测序方法助力癌症研究

　　

生物通报道：在去年圣诞节期间的加拿大落基山脉冰攀之旅中，两位来自华盛顿大学的年轻研究人员：Michael Schmitt和Jesse Salk突发奇想，谈到了一个简单但功能强大，可用于检测癌细胞，获得更好结果的新方法——如果他们能降低DNA测序中的错误率，那么就可以更好的检测出这些细胞中的变异，这种改进能用于癌症的早期诊断，以及帮助医师们了解哪些细胞会对化疗产生抗性。

上篇：

双重测序方法的诞生

双重测序方法是随着新一代测序技术的发展而诞生的，新一代测序技术近年来风头劲猛，这种能同时完成上十亿个序列测定的方法被广泛应用到了癌症，传染疾病等多个研究领域中，目前寻找预先存在的癌细胞的最直接方法就是对癌细胞进行测序，从中识别癌症相关的基因突变，但由于原有的技术存在大量的误差率，因此出来了太多假阳性结果。

Loeb实验室的一位研究人员：Scott Kennedy博士，一直都致力于完善一种称为Safe-SeqS的新一代测序方法，这种方法是去年由约翰霍普金斯大学的研究人员开发出来的。Schmitt在进入这一实验室的时候也在进行这一测序技术的研究，但是他们都未能成功利用这种方法。

“我们得到的都是一些螺旋形数字和突变类型，这些都没有任何意义”，Kennedy说，“最终我们发现这是由受损DNA造成的。”

Kennedy表示，他和Schmitt花了相当长的时间来探讨这个问题，但一直没能找到一个解决方案。在去年的那次冰攀之旅中，有一次他们乘坐飞机上山，途中Schmitt 和Salk 突然想到了双重测序的方法。

回到实验室后，Schmitt 和Kennedy 紧锣密鼓的展开了研究，他们对一种感染细菌的病毒：M13的测序数据进行了深入分析——之所以挑选M13，是因为研究人员想到了一个好方法来计算突变率。然而要实施这个相对简单的理论方法却并不容易，这需要大量的自编程程序，以及分析非常庞大的数据集。当时Salk正在泰国度假，他与Schmitt 和Kennedy一直通过电邮和Skype保持着联系。

奇妙结果

在几个星期内，华盛顿大学的这些研究人员就取得了结果：这种方法是奏效的。M13碱基替换频率为3.0×10-6，而双重测序方法则得到了几乎为2.5 x 10-6的结果，研究人员报告说。

“这相当快，这种因素联系在了一起，”Salk说，“对于科学来说，很少能按计划出牌。令我们感到惊讶的是，此前居然没有人想到过这一点。这个方法的基本原理如此之简单，之前我们大部分时间都花在寻找为何行不通的原因，思考我们错过了什么明显的东西上了。”

就这些新一代的科学家而言，不少人都是在30岁出头的时候有了一个想法，离开原来实验室。

“我认为，当你正在做你感兴趣的事情的时候，就会有好主意冒出来，”Salk说，他的祖父： Jonas Salk博士是一位医学研究人员和病毒学家，曾于1955年发现并开发了第一个脊髓灰质炎疫苗。 “对我来说，创新不会发生在一个狭小空间里。”

Genomeweb对这项技术的描述如下：

“双重测序法将24个核苷酸长的tags分割成了两个12核苷酸，添加在DNA分子的两端，研究人员将之称为‘duplex tag’。这些标记能与标准的Illumina测序接头共同作用，此后研究人员又用PCR进行扩增，获得带有普通tag的分子‘家族’，通过相同tag分子分类，研究人员就能比对其中的序列，清除那些没有出现至少三个拷贝，占据至少90%比率具有相同序列的个体，这一步能过滤掉PCR或测序过程中引入的随机误差。”

（生物通：张迪）

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原文摘要：

Detection of ultra-rare mutations by next-generation sequencing

Next-generation DNA sequencing promises to revolutionize clinical medicine and basic research. However, while this technology has the capacity to generate hundreds of billions of nucleotides of DNA sequence in a single experiment, the error rate of ∼1% results in hundreds of millions of sequencing mistakes. These scattered errors can be tolerated in some applications but become extremely problematic when “deep sequencing” genetically heterogeneous mixtures, such as tumors or mixed microbial populations. To overcome limitations in sequencing accuracy, we have developed a method termed Duplex Sequencing. This approach greatly reduces errors by independently tagging and sequencing each of the two strands of a DNA duplex. As the two strands are complementary, true mutations are found at the same position in both strands. In contrast, PCR or sequencing errors result in mutations in only one strand and can thus be discounted as technical error. We determine that Duplex Sequencing has a theoretical background error rate of less than one artifactual mutation per billion nucleotides sequenced. In addition, we establish that detection of mutations present in only one of the two strands of duplex DNA can be used to identify sites of DNA damage. We apply the method to directly assess the frequency and pattern of random mutations in mitochondrial DNA from human cells.