Nature实验技术：基因工程新工具

　　生物通报道：合成生物学是基因工程最新和最先进的阶段，能用于解决世界上最棘手的一些问题，比如能源燃料是可持续生产，关键药物的研发，以及安全清除环境里的有毒物质和放射性废物。然而为达到这些目的，科学家们必须令生物系统的设计和构建能像计算机硬件的组装那样，具有预测性。

由美国能源部劳伦斯伯克利国家实验室的著名合成生物学专家Adam Arkin领导的研究小组，近期在这方面迈进了重要的一步，他们研发出了一种“转接子”（adaptor），能通过将大肠杆菌中翻译调控因子转换成转录调控因子，令微生物元件基因工程过程变得更容易，也更易预测。

“这种转接子能集合转录调控因子，其本身的可组合性能方便微生物复杂生物环路的基因工程操控，”Arkin说，“从而能帮助研究人员建立更安全，更高效的微生物复杂功能。”

合成生物学成功的关键之一就是要在微生物中设计和构建自定义的基因开关，用于调控编码和非编码RNA的表达，作用于操纵子（在单链mRNA中共转录，带有相关功能的小基因），具有高序调控功能。

“细菌大部分调控序列都包含在5’端非翻译区域（UTRs），调控物理位置相邻的下游基因的表达，这已成为合成生物学中具有吸引力的平台，”Arkin说，“这种方法改变目标基因的表达，整合了能对定制输入产生应答的调控元件，如果要取得长效成功，那么必须满足两个条件。首先，调控部分必须易于操控，从而能产生对不同定制输入产生应答的同质突变，第二，各部分必须是可组合的，这样这些组成元件才能方便的，可预测性的被组装成具有高序功能的有机体。 ”

在细菌细胞的5’端UTRs中，有两种基本的调控因子能作为设计转录延长和翻译调控新元件的起点，转录延长调控因子通过增加多功能性和可组合性来满足第二标准，而翻译调控因子则通过易于操控性和细菌相对普遍性来满足第一个标准。

“我们这一解决方案能满足这两个条件，这种新研发的转接子基于色氨酸酶，是能将翻译启动调控因子转换成转录延长调控因子的一种色氨酸操纵子”，Arkin说，“这种转接子策略绕过了两项标准之间的严格平衡要求，因此我们认为这种方法对于能用于设计自定义元件的5’端UTRs平台的发展具有中意义。”

附：合成生物学五大挑战

挑战1：很多部件不明确

生物部件可以是从编码特异蛋白质的DNA序列到启动子（即促进基因表达的序列）的任何东西，问题是很多部件还没有被表征清楚。即使进行过测试，它们的性能也会随细胞类型的不同或不同的实验室条件而改变。

例如，设在麻省理工学院的“标准生物部件登记处”已有超过5000个可以订购的部件，但不能保证它们的质量，该登记处主任兰迪·雷特伯格（Randy Rettberg）说。其中大多数部件是由参加国际遗传工程机器设计大赛（iGEM）的大学生呈报上来的，该大赛开始于2004年，每年举办一次。在比赛中，学生们用从“工具箱”中拿来的部件或自己开发的新部件来设计合成生物系统。但是，很多参赛者没有时间表征这些部件。

挑战2：电路系统难预料

科斯林说，即使每个部件的功能是已知的，然而当这些部件组合在一起时，它们也可能不会像期望的那样工作。合成生物学家经常被试错法（trial-and-error）过程所困扰，这和其他现代工程学中发现的、具有更多预测性的设计程序不同。

“我们仍像莱特兄弟（飞机发明者）一样，把木头和纸装配在一起，”西班牙巴塞罗那基因组调控中心的合成生物学家路易斯·塞拉诺（Luis Serrano）说，“你放飞了一种东西，它坠毁了，然后你再尝试另一种东西，或许它飞得好一点。”

挑战3：复杂性难以处理

随着电路越来越大，构建和检测它们的过程将变得更加令人畏惧。科斯林团队开发的一个系统，或许是这个领域目前最常引用的成功范例——用大约12个基因在微生物中生产抗疟药青蒿素的前体。科斯林估计，该系统花费了大约150人/年（工作量计算单位，表示一个人一年完成的工作量——译者注）的工作量，包括揭示参与反应途径的基因、开发或改善部件以控制基因的表达。例如，研究人员不得不检测很多部件的变异型，最后才发现一个能充分增加酶产量的结构，而这种酶是清除一种有毒的中间分子所必需的。

设在波士顿的一家新成立的公司——“银杏生物工作室”（Ginkgo BioWorks）的共同创办人雷希玛·谢蒂（Reshma Shetty）说：“人们甚至还没有思考过应对这些项目，因为这要花费太多的经费和时间。”为了解除相似的技术瓶颈，银杏生物工作室正在开发一种联合基因部件的自动化过程。这些部件已经预定义了侧翼序列（flanking sequence），该序列由一套被称为“生物砖标准”（BioBrick standard）的规则决定，且这些部件能被机器人组装起来。

挑战4： 很多部件不相容

一旦合成的基因回路被构建并放进细胞中，它们就能对其宿主产生非预期的影响。加州大学旧金山分校的合成生物学家克里斯·沃伊特（Chris Voigt）在2003年就遇到了这个问题。沃伊特把主要来自枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）的基因部件组装进一个开关系统（该系统可对一种化学刺激做出反应——开启某些基因的表达），并想独立于其他基因网络单独研究这个系统，于是他把这个回路放进大肠杆菌中——但不起作用。

“你在显微镜下观察，大肠杆菌细胞都是病态的，”沃伊特说，“某天它在做一件事，另一天它又将做另一件事。”最后他查阅文献发现，这个基因回路中的一个部件戏剧性地破坏了大肠杆菌的自然基因表达。“基因回路的设计没有任何问题，”他说，“仅仅是一个部件不兼容。”

挑战5：可变性会毁掉系统

合成生物学家还必须确保基因回路可靠地运行。细胞内的分子活动易受随机波动和噪音的影响，生长条件的变异也能影响细胞的行为。因此，在今后很长的时间里，随机出现的基因突变完全可能毁掉基因回路的功能。

大约10年前，当加州理工学院的合成生物学家迈克尔·伊洛维兹（Michael Elowitz）领导的团队在构建一个基因振荡器（genetic oscillator）时，他观察到了细胞的随机性能力。这个系统包含3个基因，而3个基因之间的相互作用导致了一种荧光蛋白产量的升高或降低，使细胞发出或不发出荧光。不过，并非所有的细胞都有同样的反应。一些细胞更亮，一些较暗；一些闪光更快，一些较慢，还有一些细胞则完全跳过一个闪光周期。

原文摘要：

An adaptor from translational to transcriptional control enables predictable assembly of complex regulation

Bacterial regulators of transcriptional elongation are versatile units for building custom genetic switches, as they control the expression of both coding and noncoding RNAs, act on multigene operons and can be predictably tethered into higher-order regulatory functions (a property called composability). Yet the less versatile bacterial regulators of translational initiation are substantially easier to engineer. To bypass this tradeoff, we have developed an adaptor that converts regulators of translational initiation into regulators of transcriptional elongation in Escherichia coli. We applied this adaptor to the construction of several transcriptional attenuators and activators, including a small molecule–triggered attenuator and a group of five mutually orthogonal riboregulators that we assembled into NOR gates of two, three or four RNA inputs. Continued application of our adaptor should produce large collections of transcriptional regulators whose inherent composability can facilitate the predictable engineering of complex synthetic circuits.