赖良学连发PLoS ONE等文章 获克隆研究新突破

　　

生物通报道：广州生物医药与健康研究院研究员赖良学研究组，近期分别与密歇根大学研究人员，以及南方医科大学，华南农业大学的研究人员合作，在转基因克隆研究，基因敲除模型等方面获得了重要进展，分别开发出了世界首例基因敲除猪模型，以及可同时表达4种荧光蛋白的克隆猪。

赖良学研究组与南方医科大学教授顾为望，华南农业大学教授吴珍芳研究组合作，成功培育出一种特殊的转基因克隆猪，这种克隆猪在特定波长的激发光下可分别发出红、黄、绿、青4种荧光，这是国际上首次获得能够同时表达4种荧光蛋白的转基因克隆猪。这一研究成果公布在PLoS ONE杂志上。

目前，体细胞克隆技术是生产转基因大动物最有效的途径，但受体细胞增殖能力有限的影响，在此之前的研究中，每一轮克隆只能转入一个外源基因。赖良学博士领导的课题组经过潜心研究，利用2A短肽序列巧妙地将不同的荧光蛋白基因连在同一个载体上，从而只通过一轮动物克隆即成功获得了含多个外源转基因的克隆猪，不仅克服了体细胞多基因转移的技术障碍，而且实现了多基因在高水平上的协同表达。

在这篇文章中，研究人员通过电穿孔的方法将编码红色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、绿色荧光蛋白以及青色荧光蛋白的四种基因同时转入长白猪胎儿成纤维细胞，然后用表达四种荧光蛋白的细胞进行体细胞克隆，将克隆胚胎移入的代孕母猪体内，最终获得11头转基因克隆猪。目前，8头转基因克隆猪已健康成长一年多，并开始繁殖下一代。

这项研究成果的取得，标志着我国转基因克隆猪技术达到了国际领先水平，该项成果的运用，将极大地促进含多种优良性状的转基因克隆猪的研究与产业化，为今后加速我国对猪的遗传性状进行转基因改良，提高其生产性能，并制作用于人类疾病动物模型以及作为人类器官移植供体的的转基因猪研究奠定了基础。

另外一篇文章中，研究人员与美国密歇根大学心血管研究中心的研究人员合作，首次将锌指核酸酶基因打靶技术应用于猪内源性基因敲除研究，成功敲除了猪内源性PPARγ基因。此研究在世界上首次建立了对糖尿病和心血管并发症的研究有重要应用价值的PPARγ基因敲除猪模型。研究成果在线发表于Cell Research杂志上。

锌指核酸酶是一种可在DNA特定位置产生双链断裂的工程蛋白。此前，在一些低等动物身上的研究证明，锌指核酸酶技术可提高基因敲除效率，这一技术曾被美国《科学》杂志评为2009年生命科学领域十大创新技术之一。但在大动物中，该技术的应用一直没有取得成功。

在这项研究中，研究人员将锌指核酸酶技术应用于猪体细胞的基因敲除，使体细胞基因敲除的效率由原来的10-6提高到大于4%，并结合克隆技术成功获得了2头PPARγ基因敲除猪，首次实现了该技术在大动物内源性基因敲除中的应用。该研究不仅建立了高效的基因敲除猪制作技术平台，也为其它缺乏胚胎干细胞系的大动物的基因敲除提供了可靠的技术手段。

噻唑烷二酮类药物（例如文迪雅）是胰岛素增敏剂，用于治疗2型糖尿病，2006年曾经是临床上销售额最大的治疗糖尿病的药物。PPARγ是噻唑烷二酮类药物的靶点。科学家们利用小鼠的研究结果表明噻唑烷二酮类药物在治疗糖尿病的同时对心血管系统也有保护作用，但由于小鼠心血管系统与人类相差甚远，使得小鼠的研究结果与近年临床上观察到的病人心脏毒副作用不一致。因此，科学家们急需建立与人类更为接近的大动物模型来研究糖尿病及其心血管并发症。由于猪的心血管系统与人类接近，是理想的研究糖尿病和心血管疾病的动物模型，中美双方科学家合作在世界上首次得到内源性基因敲除的猪模型，将为科学家们系统性地探索噻唑烷二酮类药物的心血管副作用，以及开发新型的PPARg药物提供新的研究平台。

（生物通：万纹）

原文摘要：

Use of the 2A Peptide for Generation of Multi-Transgenic Pigs through a Single Round of Nuclear Transfer

Multiple genetic modifications in pigs can essentially benefit research on agriculture, human disease and xenotransplantation. Most multi-transgenic pigs have been produced by complex and time-consuming breeding programs using multiple single-transgenic pigs. This study explored the feasibility of producing multi-transgenic pigs using the viral 2A peptide in the light of previous research indicating that it can be utilized for multi-gene transfer in gene therapy and somatic cell reprogramming. A 2A peptide-based double-promoter expression vector that mediated the expression of four fluorescent proteins was constructed and transfected into primary porcine fetal fibroblasts. Cell colonies (54.3%) formed under G418 selection co-expressed the four fluorescent proteins at uniformly high levels. The reconstructed embryos, which were obtained by somatic cell nuclear transfer and confirmed to express the four fluorescent proteins evenly, were transplanted into seven recipient gilts. Eleven piglets were delivered by two gilts, and seven of them co-expressed the four fluorescent proteins at equivalently high levels in various tissues. The fluorescence intensities were directly observed at the nose, hoof and tongue using goggles. The results suggest that the strategy of combining the 2A peptide and double promoters efficiently mediates the co-expression of the four fluorescent proteins in pigs and is hence a promising methodology to generate multi-transgenic pigs by a single nuclear transfer.

作者简介：

赖良学
职 务: 华南干细胞与再生医学研究所 副所长 职 称: 研究员

简历：
1980年9月—1984年7月 四川畜牧兽医学院兽医系 西兽医专业 农学学士
1984年9月—1987年7月 中在国人民解放军兽医大学动物解剖学 农学硕士
1992年9月—1995年7月 东北农业大学生物工程系 理学博士
2004-2006 研究助理教授　美国密苏里大学国家猪资源保护与研究中心
2002-2004 研究助理教授　美国密苏里大学动物研究中心
1998-2002 博士后　 美国密苏里大学动物研究中心
1997-1997 副教授　 中国人民解放军农牧大学
1995-1997 博士后　 中国人民解放军农牧大学军事兽医研究所转基因动物实验室
1990-1995 讲师　 中国人民解放军兽医大学动物解剖教研室
1987-1990 助教　 中国人民解放军兽医大学动物解剖教研室

研究领域：
人和动物胚胎干细胞的建立
转基因动物的建立
动物克隆及人类治疗性克隆
体外受精及其影响因素